谈谈日本沼虾含硒谷胱甘肽过氧化物酶全长克隆与表达结论

摘要：谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）是生物体内普遍有着的一种重要的抗氧化酶，可以及时清除体内过量的活性氧分子（Reactive oxygenspecies, ROS），在生物体自身抗氧化和损伤修复中发挥重要的作用，同时在生物体对抗外界病原体入侵的自身免疫历程中也起到关键的作用；根据含硒与否，GPx可以分为含硒谷胱甘肽过氧化物酶(Se-GPx)和不含硒谷胱甘肽过氧化物酶(non-Se-GPx)，鉴于GPx在生物体存活和免疫历程中发挥的重要作用，我们以重要的淡水经济虾类—日本沼虾为探讨材料，克隆了Se-GPx基因全长序列，并对其表达情况进行了浅析。实验所用日本沼虾（体长4.5±0.5cm）捕捞于原阳黄寺渔场，实验历程中取其肝胰腺、大颚器官、血细胞、肌肉、表皮以及卵巢等组织，提取各组织中的总RNA并进行反转录，采取RACE策略以日本沼虾肝胰腺中克隆得到Se-GPx基因全长序列，并且对该序列结构进行了深入浅析，探讨了Se-GPx基因在日本沼虾各个组织中的分布情况，利用荧光实时定量PCR对日本沼虾血细胞中Se-GPx基因在蜕皮周期中以及注射嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）后的表达情况进行了检测以及浅析。采取RACE法克隆出的日本沼虾Se-GPx基因cDNA为908bp，5'-UTR的长度为91bp，3'-UTR长为256bp，包括1个保守的硒代半胱氨酸插入序列(SECIS）和1个polyA尾巴，开放阅读框(ORF)长度为561bp，编码由186个氨基酸组成的多肽，分子质量约21.2kDa，论述等电点为6.74。日本沼虾Se-GPx的第39个氨基酸为硒代半胱氨酸(Sec)，由终止子TGA编码；序列比对结果表明日本沼虾Se-GPx在甲壳动物中同罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergi）的相似度最高，为90.34%；同脊椎动物中的GPx1和GPx2家族相似性较高。组织半定量结果显示，日本沼虾Se-GPx基因mRNA在血淋巴、肝胰腺、肌肉、表皮、卵巢以及大颚器官中都有表达，在肝胰腺、卵巢和血淋巴中表达量相对较高，荧光实时定量结果显示，Se-GPx基因在日本沼虾蜕皮周期中的蜕皮前期表达量最高，而在蜕皮间期的表达量最低；利用嗜水气单胞菌对日本沼虾进行刺激，发现在注射后的3h和6h，血细胞中Se-GPx基因表达量发生了显著升高(P0.05)。实验结果表明，Se-GPx在日本沼虾蜕皮周期中发挥重要的作用，同时在日本沼虾抵御外界病原体入侵历程中起到十分重要的作用。关键词：日本沼虾论文含硒谷胱甘肽过氧化物酶论文全长克隆论文表达浅析论文

摘要4-6

ABSTRACT6-8

目录8-10

缩略语10-12

1 前言12-24

1.1 甲壳动物及其免疫12-15

1.2 活性氧分子的功能以及生物体内的抗氧化酶类15-19

1.2.1 活性氧分子在生理活动中的产生途径15-16

1.2.2 甲壳动物免疫历程中活性氧分子的产生和危害16-18

1.2.3 甲壳动物免疫系统中抗氧化酶及其功能18-19

1.3 谷胱甘肽过氧化物酶的探讨近况19-23

1.3.1 谷胱甘肽过氧化物酶的发现及功能19-20

1.3.2 含硒谷胱甘肽过氧化物酶在脊椎动物中探讨近况20-22

1.3.3 Se-GPx 在甲壳动物中的探讨近况22-23

1.4 探讨的目的与作用23-24

2 材料策略24-40

2.1 实验所需试剂和仪器24-25

2.1.1 主要试剂24

2.1.2 主要仪器24-25

2.2 实验所需物品25

2.3 Se-GPx mRNA 提取和浅析25-29

2.3.1 试剂的配制25-26

2.3.2 各组织器官总 RNA 的提取26-28

2.3.3 RNA 的检测28

2.3.4 cDNA 模板合成28-29

2.4 日本沼虾 Se-GPxcDNA 序列的克隆29-40

2.4.1 日本沼虾 Se-GPxcDNA 部分序列的获取29-33

2.4.2 日本沼虾 Se-GPxcDNA 全长的克隆33-37

2.4.3 Se-GPx 基因在日本沼虾各组织以及蜕皮周期中的表达37-39

2.4.4 嗜水气单胞菌体内免疫应激实验39-40

3 结果40-54

3.1 提取 RNA 质量检测40

3.2 PCR 产物电泳检测40-41

3.3 日本沼虾 Se-GPx 基因全长及序列浅析41-51

3.3.1 日本沼虾 Se-GPx 基因 3′、5′RACE 扩增电泳检测41-42

3.3.2 日本沼虾 Se-GPx 的 cDNA 核苷酸序列及推导的氨基酸序列42-44

3.3.3 日本沼虾 Se-GPx 与脊椎动物 GPx 氨基酸序列比对浅析44-46

3.3.4 日本沼虾 Se-GPx 与甲壳动物 Se-GPx 核苷酸序列比对浅析46-48

3.3.5 日本沼虾 Se-GPx 与甲壳动物 Se-GPx 氨基酸序列比对浅析48-49

3.3.6 日本沼虾 Se-GPx 与脊椎动物 GPx 系统进化树浅析49-51

3.4 日本沼虾 Se-GPx 基因的组织分布表达51

3.5 实时定量结果51-54

3.5.1 Se-GPx 基因在日本沼虾蜕皮周期中的表达结果51-52

3.5.2 嗜水气单胞菌刺激对 Se-GPx 基因表达的诱导52-54

4 讨论54-58

5 结论58-60

6 革新性60-62