摘要：犬细小病毒(CPV)为无囊膜的单股负链DNA病毒,是引起犬急性出血性胃肠炎和幼犬心肌炎的主要病原。该病对养犬业造成了极大的威胁。探讨病原体与宿主相互作用的一种有效手段是运用DNA微阵列技术浅析全基因组表达谱的差别。为探讨CPV与宿主细胞的互作机理,本探讨选择犬肾细胞系(MDCK)作为探讨模型,通过体外宿主细胞基因表达谱变化来预测体内感染情况,为探讨病毒的致病机理,细胞的免疫应答基因及其抗病毒机制奠定基础。一、为了解犬细小病毒的生物学特性和生物信息学特点,奠定其对宿主细胞作用的生物学背景。通过分离得到病毒,绘制病毒的一步生长曲线及检测TCID50,并设计7个重叠片段通过PCR扩增和DNA测序技术,获得分离株CPV-LZ1的全长序列。本试验获取了CPV-LZ15053nt的全长序列,包含了两末端的发卡结构,几乎包括了全部生物信息学信息,奠定了毒株的分子生物学背景。测定的TCID50为10-3.428/0.1mL,结合病毒一步生长曲线特点,奠定了毒株的生物学背景,并建立了持续感染CPV的MDCK细胞模型,为后续试验打下基础。二、为了获得感染细胞的差别表达谱,为探讨病毒的致病机理,细胞的免疫应答基因及其抗病毒机制奠定基础,通过建立持续感染CPV的MDCK细胞模型,运用Affymetrix公司的Canine Genome2.0Array基因芯片,获得MDCK的差别表达谱,并利用Real Time PCR随机验证5个差别表达谱中的基因,其结果和基因芯片杂交的结果一致。通过功能基因聚类,差别基因功能浅析,初步了解到细胞感染病毒后全基因组表达的变化情况。本试验建立了MDCK细胞持续感染CPV后的差别表达谱,探讨结果表明,通过表达谱基因芯片获得了359个差别大于1.5倍的表达基因(P0.05,占总基因数1.53%),其中193个上调表达(0.84%),166个下调表达(0.69%)。利用Real Time PCR随机验证5个基因在持续感染CPV后差别表达,其结果和芯片杂交的结果一致。对差别基因进行GO功能聚类浅析,小部分涉及免疫应答、生长周期调控、信号转导和蛋白酶活性,其它大部分基因功能未知。一部分上调表达的基因是与免疫反应相关,如趋化因子(CCL28)、主要组织相容性复合体(MHC)、蛋白酶体和集落刺激因子(C2)等；另有一部分上调表达基因与肽链内切酶活性相关,如组织蛋白酶(CTSS)、基质金属蛋白酶(MMP)等；而表达下调的基因中,大部分都与细胞增殖调控历程相关,包括细胞增殖、分化和凋亡,如金属蛋白酶抑制因子(TIMP-1)、前列腺素E、细胞凋亡推动因子(BCL2L14)等。通过浅析初步了解到CPV对宿主细胞的制约作用,引起部分细胞增殖调控相关基因发生了表达下调,以及细胞对感染的积极应答反应,部分免疫反应基因、肽链内切酶活性基因等发生了上调表达,为探讨病毒的致病机理和宿主的抗病毒途径提供了实验基础。关键词：病毒分离论文全长序列论文表达谱基因芯片论文犬细小病毒论文MDCK细胞论文表达谱论文
摘要4-6
ABSTRACT6-8
英文缩略词表8-11
前言11-13
第一章 文献综述13-26
第一节 犬细小病毒的探讨进展13-20
1. 犬细小病毒介绍13-14
2. 分子生物学特性14-17
3. 临床症状和致病性蕌17-19
3.1 临床症状17-18
3.2 病理学18-19
4. 犬细小病毒的致病机理19-20
第二节 表达谱基因芯片技术及其在兽医学探讨上的运用20-26
1. 基因芯片的概念20-22
1.1 表达谱基因芯片的运用原理21
1.2 表达谱基因芯片的技术流程21-22
1.3 基因芯片的优越性22
2. 表达谱基因芯片在兽医学中的运用22-25
2.1 基因功能的探讨22-23
2.2 动物发病机制的探讨23-24
2.3 病原体感染后细胞生物学通路探讨24-25
3. 小结与展望25-26
第二章 持续感染CPV细胞模型的建立及CPV分子生物学背景探讨26-40
1. 材料26-27
1.1 临床病料与处理26
1.2 材料与试剂26
1.3 主要仪器26-27
2. 策略27-32
2.1 持续感染细胞系的建立27
2.2 持续感染细胞系中病毒的检测27-28
2.3 病毒一步生长曲线绘制28
2.4 病毒半数组织感染量测定28-29
2.5 编码区的扩增和测序29-30
2.6 两端发卡结构的扩增、克隆和测序30-32
2.7 序列拼接及全编码区进化树的构建32
3. 结果32-37
3.1 持续感染细胞系建立32-34
3.2 病毒TCID_(50)测定34-35
3.3 病毒一步生长曲线绘制35-36
3.4 重叠片段的扩增和测序36
3.5 病毒全长序列拼接36-37
3.6 同源性及进化树浅析37
4. 讨论37-39
5. 结论39-40
第三章 表达潜基因芯片技术浅析MDCK细胞感染CPV后全基因组差别表达谱40-56
1. 材料40
1.1 材料和试剂40
1.2 主要仪器40
2. 策略40-47
2.1 RNA提取40-42
2.2 cDNA的合成和纯化42-43
2.3 aRNA合成及标记43-44
2.4 aRN段化并检测44
2.5 基因芯片杂交44-45
2.6 芯片洗脱、染色和扫描45
2.7 数据浅析45-46
2.8 荧光定量PCR进行基因水平验证46-47
3. 结果47-53
3.1 样本RNA抽提和质检47-48
3.2 aRNA的定量和检测48-50
3.3 片段化cRNA的检测50
3.4 基因芯片扫描图像50
3.5 基因芯片数据浅析50-52
3.6 Real Time PCR验证52-53
4. 讨论53-56
全文结论56-57
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