狂犬猪伪狂犬病病毒microRNA文库构建与鉴定

摘要：猪伪狂犬病(Pseudorabies, PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)所引起的一种高度接触性、急性传染病。PRV属疱疹病毒科(Herpesviridae)，α疱疹病毒亚科，该病在全球范围内给养猪业造成了巨大的经济损失。近期探讨表明，一些疱疹病毒编码的miRNA在病毒复制与调节中起着至关重要的作用。MicroRNAs(miRNAs)是一种含有约22个核苷酸的非编码单链RNA分子，广泛有着于人类及其它各种生物中。它通过与靶mRNA特异性的结合，引起靶mRNA降解或者抑制其翻译，以而调节基因的转录后表达水平。伪狂犬病毒编码miRNA的探讨才刚刚起步，由此，对伪狂犬病毒miRNA的探讨具有重要作用和学术价值。本探讨利用PK-15细胞培养猪伪狂犬病毒，接毒后在不同时间阶段收集病毒细胞培养物，分别提取不同时间段细胞培养物的总RNA；变性聚丙乙烯酰胺凝胶分离出18-26nt的小片段RNA，小RNA分子两端先后连接生物接头后进行反转录，PCR扩增后回收DN段；将所获得DN段与质粒载体连接，将连接产物转化工程菌，构建猪伪狂犬病病毒miRNA的cDNA文库。以阳性克隆菌落中随机挑取一些克隆，进行PCR扩增鉴定克隆的特性并测序，则得到20个大小正确的序列，结合生物信息学策略初步筛选出miRNA。实验结果表明，通过富集小分子RNA、反转录扩增小RNA分子，成功构建猪伪狂犬病病毒小分子RNA的cDNA文库。序列浅析和伪狂犬病病毒生物信息学相结合，筛选出1个猪miRNA和1个伪狂犬病毒miRNA，其中也有着接头自连或编码RNA降解片段，证实体外培养的伪狂犬病毒在繁殖历程中有microRNA的生成和有着。伪狂犬病毒miRNA的cDNA文库的成功构建，为伪狂犬病毒miRNA的探讨奠定了基础，但所建cDNA文库克隆数量级有限，由此，本实验涉及伪狂犬病毒microRNA的探讨只是一个开端。关键词：猪伪狂犬病毒论文microRNA论文潜伏感染论文cDNA文库论文

摘要2-3

ABSTRACT3-7

第1章 文章综述7-18

1.1 伪狂犬病探讨进展7-10

1.1.1 伪狂犬病的流行近况7

1.1.2 伪狂犬病的流行病学探讨7-8

1.1.3 伪狂犬病毒的特点8

1.1.4 伪狂犬病毒的主要蛋白及功能8-10

1.1.5 伪狂犬病毒的潜伏感染10

1.2 microRNA 的探讨进展10-16

1.2.1 病毒 miRNA 的特点及产生11-12

1.2.2 病毒 miRNA 的基因分布及表达特点12

1.2.3 病毒 miRNA 的调节作用12-13

1.2.4 病毒 miRNA 对动物疾病发生的影响13-14

1.2.5 miRNA 的其他生物学功能14-15

1.2.6 miRNA 的鉴定策略15-16

1.3 本探讨的作用16-18

第2章 猪伪狂犬病病毒 microRNA 文库的构建18-38

2.1 试验材料18-21

2.1.1 主要试验材料18

2.1.2 主要仪器设备18-19

2.1.3 主要培养基的配制19

2.1.4 主要试剂的配制19-21

2.2 试验策略21-31

2.2.1 伪狂犬病毒的培养21-22

2.2.2 细胞毒总 RNA 的提取22-23

2.2.3 Small RNA 的回收23-24

2.2.4 小分子 RNA cDNA 文库的构建24-31

2.3 结果与浅析31-36

2.3.1 伪狂犬病毒的培养31-32

2.3.2 伪狂犬病毒的鉴定32-33

2.3.3 总 RNA 提取33-34

2.3.4 小分子 RNA 的分离34-35

2.3.5 文库构建35

2.3.6 菌液 PCR 鉴定35-36

2.4 讨论36-38

第3章 猪伪狂犬病病毒 microRNA 的筛选及浅析38-40

3.1 数据库及软件38

3.2 筛选病毒 miRNA38

3.3 讨论38-40

第4章 结论40-41

4.1 猪伪狂犬病病毒 microRNA 文库的构建40

4.2 猪伪狂犬病病毒 microRNA 的筛选40-41