对于基因广西CV地方株分离、全基因序列测定和致病性

摘要：本实验通过采集广西各地临床上疑似猪瘟的组织病料,经RT-PCR策略鉴定为阳性后接种到PK15细胞,采取带毒传代的策略分离到两株猪瘟病毒GXGP03和GXLC15。对这两株进行全基因克隆并测序,GXGP03和GXLC15株全长分别是12295bp和12296bp。GXGP03和GXLC15经序列浅析发现,与HCLV、Shimen株的同源性较低,为84.2%-85.5%；与Paderborn、GXWZ02株的同源性为94.2%-94.9%。进化树浅析表明,GXGP03和GXLC15都属于Subgroup2.1,与Paderborn、GXWZ02属于同一个亚群,亲缘联系较近,与HCLV株、Shimen株亲缘联系较远,并且根据GXLC15和GXGP03株的全基因组及各个基因进行进化树的构建,发现Erns基因、NS3、NS4B、NS5A的进化树中显示的基因分群与全基因组、E2基因、NS5B进化树中的基因分群基本相似,故推测着几个基因可成为基因分群依据的潜在性基因。通过与HCLV、India疫苗株、Shimen. Shimen-HVRI、Paderborn、GXWZ02株的3'-UTR序列比较发现,GXGP03和GXLC153'-UTR与强毒株Shimen、Shimen-HVRI及中等毒力株Paderborn、GXWZ02株一样缺失14个碱基。将40株毒株与GXGP03株、GXLC15株的Erns、E2蛋白进行氨基酸序列比较。浅析Erns、E2糖基化位点,发现不同亚群毒株的糖基化位点有着差别,主要有着在数量上的差别,这是否与毒株的毒力相关,需要进一步探讨。浅析GXLC15和GXGP03株的Erns氨基酸序列,发现第476位氨基酸位点都为为Ser,没有发生变异,表明了GXLC15和GXGP03以非乙酰硫酸肝素的方式在PK15细胞上增殖。动物实验表明,GXLC15和GXGP03株对猪具有显著的致病性,在临床症状上体现为皮肤出现出血点和出血斑、腹泻、体温升高等症状,剖检后发现脾脏边缘梗死并呈锯齿状、肠系膜淋巴结出血、肿胀、肾点状出血、膀胱点状出血、腹股沟淋巴结出血、切面呈大理石花纹样等猪瘟典型症状。运用定量PCR对GXGP03攻毒后猪的分泌物、排泄物、血清进行CV的检测,发现猪在感染第6天出现病毒血症,并且在感染后第6～10天,在分泌物和排泄物中检测到CV病毒,说明CV在攻毒后第6～10天开始排毒。通过实验浅析CV毒株毒力的强弱与白细胞变化、体温变化、临床症状、排毒情况有关。本实验中GXGP03和GXLC15感染猪只后白细胞数量在第4天开始减少,抗体在第4～第10天迅速上升,抗体滴度超过1：1024,并且白细胞数量的减少和抗体滴度的升高总是出现在体温升高、产生病毒血症、皮肤出血等临床症状之前。攻毒后组织病理变化显示,GXGP03感染猪只后,产生严重病理变化的为脾脏和肺脏。根据动物实验的临床症状、病理变化、结合GXGP03和GXLC15的分子生物学特性可判断GXLC15和GXGP03株是中等毒力的毒株,病程呈亚急性经过。关键词：猪瘟病毒论文全基因论文遗传进化论文序列浅析论文基因分型论文致病性论文实时定量PCR论文

摘要4-6

ABSTRACT6-8

目录8-11

第一章 综述11-23

第一节 猪瘟病毒的分子生物学特点11-16

1.1.1 5’-NTR和3’-NTR12-13

1.1.2 结构蛋白13-14

1.1.3 非结构蛋白14-16

第二节 猪瘟病毒的毒力基因16

第三节 猪瘟病毒的基因分型16-17

第四节 CV的致病机制17-18

第五节 猪瘟的流行走势18-22

1.5.1 国外猪瘟的流行情况18-21

1.5.2 中国猪瘟的流行情况21-22

第六节 探讨的目的和作用22-23

第二章 猪瘟病毒的分离及全基因序列浅析23-54

第一节 材料与策略23-27

2.1.1 材料23-24

2.1.2 策略24-27

第二节 结果27-50

2.2.1 病毒的分离27

2.2.2 GXGP03及GXLC15全基因的扩增27-28

2.2.3GXGP03和GXLC15株的全基因遗传进化浅析28-45

2.2.4 GXGP03和GXLC15株的重要氨基酸位点浅析45-49

2.2.5 GXGP03和GXLC15株的3'-UTR的序列浅析49-50

第三节 讨论50-54

2.3.1 病毒的分离50

2.3.2 基因分型50-51

2.3.3 GXGP03、GXLC15与Paderborn、GXWZ02间的进化联系51

2.3.4 GXGP03、GXLC15分离株Erns、E1、E2蛋白的糖基化位点浅析51-52

2.3.5 GXGP03和GXLC15氨基酸位点变化的影响52-54

第三章 GXGP03和GXLC15株的致病性探讨54-80

第一节 材料与策略54-56

3.1.1 材料54

3.1.2 策略54-56

第二节 结果56-73

3.2.1 CV定量PCR标准曲线的构建56-58

3.2.2 GXGP03株和GXLC15株攻毒后的体温变化58-59

3.2.3 GXGP03株和GXLC15株攻毒后的猪的白细胞变化59-60

3.2.4 GXGP03和GXLC15株攻毒后的抗体变化60-61

3.2.5 GXGP03株攻毒后的临床症状和GXLC15株攻毒后的临床症状的评分61-63

3.2.6 运用定量PCR对GXGP03攻毒后猪只分泌物、排泄物、内脏器官的检测63-65

3.2.7 GXGP03感染猪的病理变化65-71

3.2.8 GXLC15感染猪的病理变化71-73

第三节 讨论73-80

3.3.1 GXGP03和GXLC15的体温变化73-74

3.3.2 GXGP03和GXLC15的白细胞变化74

3.3.3 GXGP03和GXLC15的抗体变化规律74-75

3.3.4 GXLC15的临床评分和GXGP03攻毒后的临床症状75

3.3.5 CV感染猪后临床症状、体温变化、病毒含量等之间的相关性75-76

3.3.6 GXGP03病理变化76-77

3.3.7 GXGP03攻毒后的排毒77-78

3.3.8 GXGP03和GXLC15的毒力78

3.3.9 猪瘟的防治78-79

3.3.10 运用定量PCR和ELISA试剂盒对病原和抗体检测的相关不足79-80

第四章 全文结论80-81