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摘要：第一部分ASP-PCR和FQ-PCR策略检测Klotho基因G-395A、F352V、C370S多态性的比较目的探讨Klotho基因G-395A、F352V、C370S多态性准确可靠的实验检测策略。策略运用等位基因特异引物-聚合酶链式反应(allepc specific primer polymerase chain reaction, ASP-PCR)技术及实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, FQ-PCR)技术检测Klotho基因G-395A、F352V、C370S位点的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphi, SNP),比较浅析两种策略对上面陈述的三个SNP位点检测的差别。结果①ASP-PCR策略检测G-395A位点的实验结果不稳定、重复性差；F352V位点未发现V等位基因扩增产物；C370S位点的目的扩增片段不清晰,非特异性扩增产物多。②FQ-PCR策略检测G-395A、F352V、C370S位点的实验结果稳定、重复性好、效果理想、易于判断基因型,测序后基因型结果一致。结论ASP-PCR技术可能不适用于Klotho基因G-395A、F352V、C370S位点的多态性检测,FQ-PCR技术能准确进行这三个位点的多态性浅析。第二部分Klotho的三个位点SNP与2型糖尿病合并下肢动脉粥样硬化的相关性探讨目的探讨Klotho勺3个SNP位点(G-395A,F352V,C370S)基因型与中国昆明地区汉族人2型糖尿病及2型糖尿病合并下肢动脉粥样硬化的相关性。策略运用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, FQ-PCR)技术,分别对237例2型糖尿病(B组)患者[无下肢动脉粥样硬化(B1)组79例,合并下肢动脉粥样硬化(B2)组158例]和85例健康对照者(A组)检测Klotho基因3个SNP位点的基因型,并比较浅析各组间基因型频率、等位基因频率及相关临床指标。结果①Klotho基因G-395A多态性,GG、GA及AA基因型频率分别为69.9%(225例)、25.8%(83例)、4.3%(14例),等位基因G和A的频率分别为82.8%和17.2%。②Klotho基因F352V、C370S位点间为完全连锁不平衡,所有样本中未发现突变纯合型(VV、SS型),杂合型(FV、CS型)仅发现2例,其余均为野生型(FF、CC型)。③Klotho基因G-395A多态性在A组和B组中的基因型及等位基因频率无统计学差别(χ2=0.290,P=0.590；χ2=0.229,P=0.633),B2组的GA+AA基因型频率高于B1组(χ2=4.456,P=0.035)。④Klotho基因G-395A的杂合型GA及纯合型AA与2型糖尿病下肢动脉粥样硬化的发生独立相关(OR=3.199,95%CI：0.860-11.893)。结论①在中国昆明地区汉族人中有着Klotho基因G-395A、F352V、C370S多态性,F352V和C370S位点间为完全连锁不平衡,其多态性罕见。②Klotho基因G-395A位点的杂合型GA及突变纯合型AA可能是2型糖尿病合并下肢动脉粥样硬化的遗传危险因子。第三部分血浆Klotho水平与2型糖尿病及骨密度转变的相关性探讨目的探讨昆明地区汉族人群中血浆中Klotho水平与2型糖尿病(T2DM)及骨密度(BMD)转变的相关性。策略采取双抗体夹心酶联免疫吸附法(Enzyme pnked immuno sorbent assay, ELISA),检测220例2型糖尿病患者(T2DM组)和76例正常对照者(NC组)血浆中Klotho水平,并测定相关临床资料和生化指标,比较组间差别。利用美国GE公司的双能X线骨密度仪对159例T2DM患者进行骨密度测定,根据WH01994年推荐的骨质疏松标准将T2DM患者分为3个组：骨量正常(BMD0)组77例,骨量减少(BMD1)组59例,骨质疏松(OP)组23例,浅析T2DM患者骨密度转变与Klotho水平的联系及其影响因素。结果①T2DM组血浆Klotho水平低于NC组(4.92±0.47vs5.38±0.60,P0.01),协方差浅析后Klotho水平仍有着组间差别(P0.01)；②多元逐步回归浅析显示,胰岛素敏感指数(ISI)和血肌酐(Scr)是Klotho水平的独立相关因素(B分别为2.743、-0.004,P均0.05)；③BMDO组、BMD1组和OP组间血浆Klotho水平比较无统计学差别(4.95±0.48vs4.96±0.47vs4.91±0.49,P0.05)；④第1、2、3、4腰椎、腰椎均值、股骨颈、股骨大粗隆和全身均值骨密度与血浆Klotho水平均无相关性(P均0.05)；⑤Logistic回归浅析显示,年龄、DM病程、HDL-CIBMI是影响T2DM患者骨密度转变的独立相关因素(B分别为0.037、0.005、-1.011、-0.175,OR分别为1.038、1.005、0.364、0.84)。结论(1)T2DM患者血浆Klotho水平降低,其水平与胰岛素敏感指数独立相关,血浆Klotho水平可能是一个反映患者胰岛素抵抗及T2DM发生的监测指标。(2)T2DM患者骨密度下降及骨质疏松可能与血浆Klotho水平无相关性,而年龄和DM病程是其危险因素,HDL-C和BMI是其保护因素。关键词：Klotho基因论文ASP-PCR技术论文FQ-PCR技术论文Klotho基因论文单核苷酸多态性论文糖尿病论文2型动脉粥样硬化论文Klotho蛋白论文糖尿病论文2型骨密度论文胰岛素抵抗论文
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文中主要英文縮写5-6
摘要6-7
Abstract7-13
前言13-16
第一部分 ASP-PCR和FQ-PCR策略检测Klotho基因G-395A、 F352V、 C370S多态性的比较16-34
引言16-17
材料与策略17-24
结果24-30
讨论30-33
结论33-34
第二部分 Klotho的三个位点SNP与2型糖尿病合并下肢动脉粥样硬化的相关性探讨34-49
引言34-35
材料与策略35-36
统计学处理36
结果36-44
讨论44-48
结论48-49
第三部分 血漿Klotho水平与1型糖尿病及骨密度转变的相关性探讨49-58
引言49
材料与策略49-52
统计学处理52
结果52-55
讨论55-58
结论58