摘要：小干扰RNA（siRNA）能通过RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术在mRNA水平通过抑制靶基因的表达以而下调蛋白的表达。siRNA因其高特异性的基因沉默效率和低毒性等特点被认为是最具潜力的抗肿瘤药物。然而由于血液中有着的核酸酶及带正电荷的一些蛋白的有着使siRNA在血液中不稳定，这就使得将siRNA传递到肿瘤细胞成为一个非常具有挑战性的任务。为了解决这个不足，许多siRNA传递系统进展起来。在这些系统中，主要包括：脂质依赖的系统、聚合物依赖的系统、肽结合系统、不同抗体单链片段融合蛋白系统。在这些不同载系统统中，阳离子脂质体因具有可自然降解、生物相容性好；可以将siRNA浓缩为带正电荷的磷脂复合物，免受核酸酶的降解等优点，使其成为自20世纪八十年代受到探讨者的重视和运用最广泛的载体。为了进一步沉默靶基因，配体修饰的免疫脂质体成为当前的探讨热点。目前，Huang等发明的茴香酰胺靶向的LPD(Liposome-Polycation-DNA)载系统统能将siRNA有效地传递到σ受体过表达的肿瘤细胞。为了使LPD成为利用更广泛的载系统统，我们首次将抗体（anti-EGFR的Fab’）运用在LPD上，制得高PEG含量的TLPD-FCC。探讨结果显示TLPD-FCC能有效的将siRNA传递到EGFR高表达的乳腺癌细胞，并具有良好的体内外基因沉默效率。然而，TLPD-FCC在EGFR高表达的肝癌细胞中并没有显示较好的基因沉默活性。由此，为了提升TLPD-FCC在肝癌细胞的基因沉默活性，本探讨在我们之前的探讨基础上对TLPD-FCC进行了一些改造，包括降低PEG化程度和增加抗体连接效率等来优化处方，然后对该处方进行深入的体内外抗肿瘤活性的探讨。首先，我们通过薄膜分散法制备DOTAP/Chol脂质体，然后将脂质体与鱼精蛋白、小牛胸腺DNA、siRNA混合制的裸的LPD，然后将PEG和抗体通过一定方式插入LPD中得到EGFR靶向的免疫脂质体。由于PEG化程度和抗体连接方式是影响脂质体靶向效率的两个主要因素，由此我们制备了不同PEG化程度（含PEG分别为5mol%、7.5mol%、10mol%）和不同抗体连接方式（传统策略和后插入策略）的免疫脂质体TLPD，然后以粒径、zeta电位、抗体连接效率、siRNA基因沉默效率为指标进行处方优化，最后得到通过后插入策略制备的含7.5mol%PEG的免疫脂质体TLPD-FP75为最佳处方。然后我们考察了靶向与非靶向免疫脂质体（TLPD-FP75和NTLPD-FP75）对siRNA的结合能力、包封率、siRNA的血清稳定性、细胞内吞、转染效率和基因沉默效率。凝胶阻滞实验表明NTLPD-FP75和TLPD-FP75对siRNA均具有较强的结合能力，这与高包封率（85%）的结果一致。体外血清稳定性实验表明该载体能显著的延长siRNA在血清中的时间至144h。通过共聚焦显微镜观察细胞内吞情况，发现转染TLPD-FP75的细胞中CFPE和Cy5-siRNA标记显著高于含NTLPD-FP75细胞，说明TLPD-FP75可以通过配体-受体介导的方式将siRNA内吞到细胞内。TLPD-FP75在不同EGFR表达的肝癌细胞（MC-7721/Hep3B/LM3）中转染效率和基因沉默效率的结果表明：TLPD-FP75的转染效率和基因沉默效率显著高于NTLPD-FP75，且具有一定的抗原特异性。在抗RhoA-siRNA实验中，TLPD-FP75能有效的下调RhoA的表达并抑制细胞的迁移。在体内实验中，我们建立了MC-7721裸鼠的肝脏原位癌模型，探讨了转运siRNA脂质体的体内分布情况、细胞吸收及其基因沉默活性。体内组织分布结果表明，同NTLPD-FP75组相比，TLPD-FP75组能显著增加siRNA在肿瘤部位的聚集；另外体内细胞吸收结果显示，TLPD-FP75主要通过受体介导的内吞方式有效的聚集在肿瘤细胞。更为重要的是TLPD-FP75的体内基因沉默效率是要显著高于其它形式的脂质体。综上，本探讨通过后插入策略制备的含7.5mol%PEG的的免疫脂质体能特异性的将siRNA传递到EGFR过表达的肝癌细胞内，并具有良好的抗肿瘤活性。由此该载体可以作为潜在的基因治疗手段用于肝癌的临床治疗。关键词：靶向LPD论文siRNA论文PEG化论文肝癌论文EGFR论文基因沉默论文体内和体外论文
摘要6-8
ABSTRACT8-11
缩略词表11-12
前言12-15
第一章 TLPD的制备及 PEG 化程度和连接方式的优化15-27
一、 仪器与材料15-16
（一） 主要仪器设备15
（二） 细胞株15
（三） SIRNA15
（四） 主要材料和试剂15-16
二、 策略16-21
（一） EGFR 靶向脂质体（TLPD）的制备16-19
（二） PEG 化程度和抗体连接方式的优化19-21
三、 结果与讨论21-26
（一） 不同 PEG 化及抗体插入方式的 TLPD 的制备21-22
（二） PEG 化程度和抗体连接方式的优化22-26
四、 本章小结26-27
第二章 TLPD-FP75 的性质及体外活性探讨27-44
一、 仪器与材料27-28
（一） 主要仪器设备27
（二） 细胞株27
（三） SIRNA27
（四） 主要材料与试剂27-28
二、 策略28-33
（一） TLPD-FP75 相关性质的探讨28-30
（二） TLPD-FP75 体外活性的探讨30-33
三、 结果与讨论33-43
（一） TLPD-FP75 的相关性质33-35
（二） TLPD-FP75 的体外活性的探讨35-43
四、 本章小结43-44
第三章 TLPD-FP75 体内抗肿瘤活性探讨44-53
一、 仪器与材料44-45
（一）主要仪器设备44
（二） 细胞株及实验动物44
（三） SIRNA44
（四） 主要材料与试剂44-45
二、 策略45-47
（一） 裸鼠人肝癌肿瘤移植模型的建立45
（二） 免疫荧光染色法观察乳腺癌实体肿瘤的 EGFR 表达45
（三） 组织分布的探讨和体内细胞内吞实验45-46
（四） 体内基因沉默效率考察46-47
三、 结果与讨论47-52
（一） 验证裸鼠人肝癌肿瘤移植模型的建立47
（二） 免疫荧光染色法观察实体肿瘤中 EGFR 的表达47-48
（三） 组织分布的探讨和体内细胞内吞实验48-50
（四） 体内基因沉默效率50-52
四、 本章小结52-53
全文小结53-55
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