摘要：FB2是一种新型Abl/Src双重酪氨酸激酶抑制剂,属于噻唑嘧啶胺类化合物。药理学探讨表明,FB2可抑制伊马替尼耐药细胞株(K562/G5.0和K562/G01)、人前列腺癌细胞DU145和人乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖,还可显著延长K562/G5.0细胞NOD/SCID小鼠和Ba/F210(WT和Y253F)白血病小鼠的存活期。此外,FB2还可抑制Ba/F210WT及Y253F细胞Bcr/Abl、c-Src和Lyn蛋白的磷酸化水平,对Src激酶活性的抑制作用强于达沙替尼。由此可见,FB2作为一种新型、有效的抗白血病化合物,有望成为治疗伊马替尼耐药CML的新药。本探讨根据临床前药代动力学指导原则,建立了生物样品中FB2及代谢产物的LC-MS/MS浅析策略,该策略简便、可靠、灵敏度高、特异性强,可满足FB2的临床前药动学探讨。运用LC-MS/MS策略检测并浅析大鼠口服和静脉注射FB2后的体内吸收、分布、代谢和排泄的药代动力学特点；鉴定参与FB2代谢的Ⅰ相和Ⅱ相同工酶业型以及产物生成的相关性；探讨FB2与药物代谢酶/P-糖蛋白相互作用以及Beagle犬口服不同FB2制剂的药代特点比较等,为临床药代动力学探讨和合理用药提供参考依据。探讨结果表明：1.雄雌大鼠口服FB2(9、18、36mg/kg)后5min血中均可检测到原型药和代谢物,12～24h血药浓度接近检测限。雄鼠低、中、高剂量组FB2的Cmax分别为83.62、245.60和202.80ng/mL,Tmax为0.3、0.35和0.38h,AUC(0-t)为117.03、402.68和440.53μg/L*h,MRT(0-t)为2.07、4.11和4.32h。FB2的Cmax、AUC (o-t)与口服剂量不成比例,MRT(0-t)无显著转变,提示FB2在雄鼠体内可能有着吸收饱和现象。代谢物FB7的Cmax分别为32.32、63.40和69.94ng/mL,Tmax为1.20、0.45和0.85h。AUC(0-t)为139.01、288.60和486.13μg/L*h,MRT(0-t)为3.95、5.30和6.92h；FB10的Cmax分别为156.80、310.20和277.60ng/mL, Tmax为0.30、0.30和0.25h,AUC(0-t)为535.30、1160.90和1769.86μg/L*h,MRT(0-t)为4.56、6.05和7.80h。代谢物FB7和FB10的Cmax与口服剂量不呈比例,但AUC(0-t)与口服剂量呈比例联系(R2=0.9878和0.9613),MRT(0-t)随给药剂量增加而延长。提示代谢物在雄鼠体内可能有着一定的消除饱和现象。雌鼠口服FB2(9、18、36mg/kg)后,低、中、高剂量组FB2的Cmax分别为46.84、170.70和493.80ng/mL,AUC(0-t)分别为144.29、528.09和1933.35μg/L*h, MRT (o-t)为5.24、7.15和6.23h；FB7的Cmax分别为22.60、57.84和110.56ng/mL,AUC(0-t)为128.19、385.11和1054.63μg/L*h,MRT(o-t)为5.63、6.95和6.71h；FB10的Cmax分别为119.96、209.40和339.20ng/mL,AUC(0-t)为645.46、1344.85和2928.96μg/L*h,MRT(0-t)为5.79、7.42和7.11h。雌鼠FB2、FB7和FB10的Cmax和AUC(0-t]与给药剂量基本呈正比(R2=0.9836-0.9991),MRT(0-t)并未随剂量增加而延长,提示FB2和代谢物FB7、FB10在雌鼠体内的代谢基本符合线性动力学特点。雌鼠FB2(36mg/kg)的口服生物利用度为11.96%,雄鼠为3.04%。雌鼠各剂量组FB2及代谢产物的AUC(0-t)和MRT(0-t)高于雄鼠,提示FB2在大鼠体内的药代动力学有着显著性别差别。雄鼠口服FB2(9mg/kg)后,FB2、FB7和FB10自粪便的回收量分别为口服剂量的13.56%、11.37%和69.93%,雌鼠粪便中回收量分别为6.89%、12.20%和64.19%,胆汁和尿液中排泄较少。FB2和代谢物在体内分布广泛,雄鼠给药8min后,组织和器官中药物浓度排序为：胃小肠脾肝脏脂肪肾上腺肺附睾肌肉骨髓肾脏睾丸血浆心脏脑,15min和2h后FB2在脂肪组织的分布显著减少。给药后各时间点代谢物在肝脏、脾、肾上腺和消化道分布较多。雌鼠给药8min后,组织和器官中原型药浓度排序为：胃肝脏小肠骨髓肾上腺肌肉肺脾心脏卵巢子宫血浆肾脏脂肪脑,15mmin和2h的分布走势与8min相似。代谢物在肝脏、肾上腺、消化道等组织分布较多,各时间点分布走势基本相同。FB2体外与大鼠、犬、入和猴血浆蛋白高度结合,结合率约为96.45～100%,无显著种属差别。2. Beagle犬口服FB27#制剂(12mg/kg)后15～30min血中即可测到原型药,12-24h FB2血药浓度仍高于检测限。雄犬FB2、FB7和FB10的Cmax分别为91.15、66.98和7.41ng/mL, Tmax分别为3.67、3.67和2.33h；雌犬FB2、FB7和FB10的Cmax分别为29.93、31.71和8.11ng/mL,Tmax分别为3、2和0.75h。雄犬FB2及代谢产物的AUC(o-t)、Tmax和MRT(0-t)均显著高于雌犬,提示可能有着性别差别。Beagle犬口服7#制剂45mmin后,除♂1正常外,其余各只头部和前肢均显著肿胀,精神萎靡,1-2h后症状逐渐消失,恢复正常。与7#制剂相比,8#制剂(12mg/kg)的Cmax和AUC(0-t)显著升高,MRT(0-t)、Tmax和t1/2z缩短,提示8#制剂在Beagle犬体内吸收和消除较快,无显著性别差别,也无7#制剂的不良反应。3.FB2在犬、人、猴和大鼠肝微粒体温孵1h后分别减少17%、15%、96%和58%。在大鼠／人肝微粒体中可代谢生成多个代谢产物,包括氧化代谢物：FB7和FB10(m/z=610/472),原型药的葡萄糖醛酸结合物：G1(m/z=770/456)和氧化代谢物的葡萄糖醛酸结合物：G2和G3(m/z=786/472)。FB2在大鼠和人肝微粒体中生成的代谢产物的类型和数目基本一致,但产物的相对丰度不同。大鼠口服FB2(9mg/kg)后的尿液、胆汁、血浆和粪便中均可检测到氧化代谢物：FB7和FB10(m/z=610/472)、氧化代谢物的葡萄糖醛酸结合物G4(m/z=786/472)及硫酸结合物S1(m/z=690/472)。此外,在尿液、胆汁和血浆中还检测到另一氧化代谢物：FB3(m/z=610/472)。各体内样品中均未检测到原型药的Ⅱ相结合产物。FB2在犬、人、猴和大鼠血浆中均稳定。4.参与FB2生物转化的大鼠肝脏CYP450主要同工酶为CYP3A2和2E1,2C11、1A2、2C6和2D2部分参与,代谢产物主要为FB7和FB10。人源CYP3A4是参与FB2体外代谢生成FB7和FB10的主要同工酶,2C9部分参与。Ⅱ相代谢酶UGT1A1、1A4、1A9和2B7是参与FB2-G生成的主要同工酶；1A4、1A9和2B7主要催化FB7-G生成；lAl和2B7主要催化FB10代谢生成FB10-G。5.FB2(10μM)经Caco-2细胞的吸收渗透系数(PappA-B)为13.99×10-6cm/s,提示FB2是一种高渗透性药物。FB2、FB7和FB10的PappB-A均高于PappA-B,当加入P-gp抑制剂LSN335984后外排率显著降低,提示FB2、FB7和FB10均是P-gp底物,MDCK-MDR1细胞探讨进一步确认FB2为P-gp底物。在大鼠single-pass肠灌注液中加入P-gp抑制剂LSN335984后,FB2代谢率略降低,FB2的Pblood和血中代谢物FB7、FB10累积量均显著升高。大鼠口服FB2(18mg/kg)后,Foral仅为5.7%,联用P-gp抑制剂维拉帕米后,Foral提升到24.52%,代谢物FB7和FB10的AUC(0-t)和Cmax也显著增高。以上结果表明,抑制P-gp可以减少FB2和代谢物(FB7和FB10)的外排,以而推动FB2和代谢物在肠道的吸收。由此,P-gp对肠道FB2的吸收和转运影响是FB2口服生物利用度低的主要因素之一6.Caco-2细胞模型中加入FB2、FB7和FB10(10μM)后,地高辛的ER值降低74%、71.6%和29.2%,提示FB2、FB7和FB10对P-gp产生不同程度的抑制作用。FB2、FB7和FB10(1、5、10μM)处理CaCo-2细胞72h后发现FB2对P-gp并无诱导作用,却体现出较强的抑制作用,ER值分别下降43.8%、52%和83%。加入FB7(1、5、10μM)和FB10(1、5μM)后对P-gp诱导作用较弱。7.FB2(1-10μM)对体外大鼠肝CYP4506个同工酶(CYP1A2、3A2、2C6、2C11、2D2和2E1)均有不同程度的抑制作用,抑制率为21.81-52.95%不等。FB2(1-10μM)体外对人肝CYP2D6、2E1和3A4的抑制率分别为17.58-54.55%不等,对1A2、2C9和2C19影响较小。FB2(1-10μM)对人肝UGT1A1、1A4、1A9和2B7抑制率为5.14-44.44%；FB7对UGT1A1、1A4和2B7抑制率为3.7%-40.7%,对1A9无显著影响。FB10对UGT1A1,1A4,1A9和2B7抑制率为5.14%-53.44%,。以上结果提示,FB2与代谢产物FB7和FB10可不同程度的抑制药物代谢酶活性。8.FB2(9、18、36mg/kg)多次给药对大鼠肝脏主要CYP450同工酶、UDPGT和GST活性均无显著影响。关键词：FB2论文药代动力学论文生物转化论文P-糖蛋白论文相互作用论文
缩略词表6-8
中文摘要8-12
英文摘要12-17
前言17-18
第一节 Hplc-MS/MS测定生物样品中FB2及代谢物FB7和FB10策略的建立18-32
1. 材料18-19
2. 实验策略19-21
3. 实验结果21-32
3.1. 策略专属性21-27
3.2. 回归曲线和灵敏度27-29
3.3. 精密度与准确度29-30
3.4. 回收率30
3.5. 基质效应30
3.6. 稳定性30
3.7. 血浆样品稀释对FB2测定的影响30-32
第二节 大鼠口服和静脉注射FB2的体内药代动力学探讨32-60
1. 材料32
2. 实验策略32-33
3. 实验结果33-57
3.1. 大鼠口服FB2后的血浆药代动力学33-42
3.2. 大鼠静脉注射FB2后的血浆药代动力学42-44
3.3. 大鼠口服FB2后体内各主要脏器和组织的分布44-53
3.4. 大鼠口服FB2后自粪便、尿液和胆汁的排泄53-56
3.5. FB2与大鼠、犬、人和猴血浆蛋白结合56-57
4. 讨论57-60
第三节 Beagle犬口服FB2不同制剂的体内药代动力学探讨60-71
1. 材料60
2. 实验策略60-61
3. 实验结果61-70
3.1. 犬血浆FB2、FB7和FB10标准曲线61
3.2. Beagle犬口服两种FB2制剂的血浆药代动力学61-70
4. 讨论70-71
第四节 FB2的生物转化探讨71-101
1. 材料71
2. 实验策略71-74
3. 实验结果74-98
3.1. FB2体内外代谢产物鉴定74-85
3.1.1. FB2体外肝微粒体Ⅰ相代谢产物鉴定74-76
3.1.2. 大鼠口服给药后尿液、胆汁、粪便和血浆中Ⅰ相代谢产物鉴定76-78
3.1.3. FB2体外肝微粒体Ⅱ相代谢产物鉴定78-79
3.1.4. 大鼠口服给药后尿液、胆汁、粪便和血浆中Ⅱ相代谢产物鉴定79-85
3.2. FB2在犬、人、猴、大鼠肝微粒体和血浆中的稳定性85-87
3.3. 参与FB2代谢的大鼠肝微粒体CYP450同工酶鉴定87-90
3.4. 参与FB2代谢的人肝微粒体CYP450同工酶鉴定90-96
3.4.1. 选择性抑制剂对FB2体外代谢的影响90-94
3.4.2. 特异性CYPs抗体对FB2体外代谢的影响94-95
3.4.3. 重组人源CYP450酶对FB2代谢的影响95-96
3.5. 参与FB2、FB7和FB10代谢的人肝微粒体UDPGT鉴定96-98
4. 讨论98-101
第五节 FB2和代谢物FB7、FB10与P-gp的相互作用101-118
1. 材料101
2. 实验策略101-105
3. 实验结果105-115
3.1. P-gp对FB2肠道吸收的影响105-114
3.1.1. FB2、FB7和FB10经Caco-2细胞的转运105-107
3.1.2. FB2自大鼠小肠single-pass灌流模型的吸收107-111
3.1.3. P-gp抑制剂对大鼠口服FB2后生物利用度的影响111-114
3.2. FB2、FB7和FB10体外对Caco-2细胞P-gp的抑制作用114
3.3. FB2、FB7和FB10体外对Caco-2细胞P-gp的诱导作用114-115
4. 讨论115-118
第六节 FB2对药物代谢酶的诱导/抑制作用118-129
1. 材料118
2. 实验策略118-121
3. 实验结果121-126
3.1. FB2对大鼠肝脏CYP450同工酶的体外抑制作用121-122
3.2. FB2对人肝脏CYP450同工酶的体外抑制作用122
3.3. FB2、FB7和FB10对人肝微粒体UDPGT同工酶的抑制作用122-125
3.4. FB2多次给药后对大鼠CYP450同工酶活性的诱导作用125-126
3.5. FB2多次给药后对大鼠UDPGT和GST活性的诱导作用126
4. 讨论126-129
结论129-131
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