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摘要：对Presenipns(PS)基因的功能探讨主要集中于其作为Y分泌酶的组成部分参与AβPP(Aβ前体)的剪切和amyloid-β(Aβ)的形成。但是在没有Aβ沉积时,PS基因功能缺失也引起类似阿尔兹海默症(AD)的神经退行性变化。线粒体结构和功能的转变在AD中很常见。神经元凋亡是神经退行性变化的体现之一,位于线粒体内膜的PS1诱导了线粒体途径的细胞凋亡。本探讨首先通过RNA干扰技术构建了PS1基因表达下调的瞬时转染SHSY5Y细胞模型,并对RNA干扰序列及干扰条件作了优化筛选。探讨表明PS1表达下降引起线粒体水平presenipns-associated rhomboid-pke(PARL)蛋白的表达下调及受其调控的下游因子optic atrophy type1(OPA1)表达下降,其中OPA1除作为线粒体动力蛋白参与线粒体融合历程外,还与线粒体脊的构建和膜的完整性有关。同时,在PS1缺失的SHSY5Y细胞中caspase3前体表达下降,凋亡活化体增加,呈现DNA断裂和cytochrome c (cyt c)释放等凋亡特点。结果提示：PS1缺失能引起PARL-OPA1介导的线粒体途径的细胞凋亡并引发神经退行性变化,是对AD病发的分子机制的一种探讨。在凋亡通路探讨中还用到了本实验室构建的shRNA (short hairpin RNA)干扰的PS1表达下调的稳定转染SHSY5Y细胞模型。1.PS1基因缺失的SHSY5Y siRNA干扰模型的构建和鉴定PS(PS1和PS2)基因突变是遗传性阿尔兹海默症的主要致病因素,已发现有182种PS1基因的突变与遗传性阿尔兹海默有关。前脑敲除PS1和PS2的双转基因小鼠体现出神经退行性变化的症状如近期记忆缺失,前脑退化和认知能力如解决不足的能力和语言能力的损害。PS1和PS2双敲鼠的大脑中无Aβ沉积,因PS基因缺失引起的老年痴呆样病变的分子机制尚不清楚,并且在双敲鼠中发现,PS基因的缺失引起一系列神经凋亡的体现,如神经元丢失、星形胶质增生、caspases3活化体的出现等。由此我们试图揭示PS1基因是否直接引起神经退行性变化以及探讨PS1基因的相关功能。下调特定基因的表达并观察相关现象是探讨某个基因功能的良好途径。我们利用RNA干扰技术在神经母瘤细胞SHSY5Y上构建PS1下调表达的瞬时转染模型。其中在设计的3条siRNA序列中筛选出最佳序列,并利用此序列进行最佳干扰时间的选择,在RNA干扰24h、36h、48h、60h后PS1基因均显著下调,干扰48h后PS1表达下降最显著,在后续实验中siRNA作用时间均为48h。2.PS1缺失介导PARL-OPA1相关的线粒体凋亡途径在构建的PS1RNAi瞬转SHSY5Y模型和稳转SHSY5Y模型中均检测到线粒体途径细胞凋亡相关因子OPA1和PARL在RNA水平和蛋白质水平的显著的下调表达,在凋亡通路中,PARL位于OPA1的上游。在线粒体途径的细胞凋亡中会发生线粒体外膜结构的破坏,膜间隙的很多蛋白会外流到细胞浆中。在正常的细胞中细胞色素C贮藏在线粒体的紧凑结构脊中,在其它凋亡因子的诱导下,线粒体膜系统遭到破坏,细胞色素C以线粒体脊流到膜间隙直至外流到胞浆中,细胞色素C是线粒体途径凋亡的主要标志。PS1缺失的SHSY5Y细胞中,线粒体中的细胞色素C显著减少,证实了PS1通过线粒体途径影响神经退行性变化。Caspase3是凋亡活动的最终执行者之一,是细胞凋亡发生的主要标志,在PS1缺失的细胞中发生了caspase3前体的剪切和活化体的出现,显示PS1的表达下调介导了caspase3参与的凋亡机制。在细胞凋亡中,DNA会断裂成180bp或其倍数的片段,TUNEL是检测细胞凋亡的经典策略。我们用1mM的H2O2处理PS1缺失的SHSY5Y细胞和正常的SHSY5Y细胞,PS1下调表达组的细胞凋亡情况与正常组差别显著。关键词：PS1论文RNAi论文线粒体论文PARL论文OPA1论文
摘要6-9
Abstract9-14
第一章 Presenipn1基因缺失的SHSY5Y siRNA干扰模型的构建和鉴定14-30
摘要14
前言14-16
材料和策略16-22
结果22-23
1. PS1 siRNA最佳干扰序列的筛选22
2. PS1 siRNA最佳干扰时间的筛选22
3. PS1基因表达的鉴定22-23
4. PS1基因表达下调对PS2基因的影响23
讨论23-25
1. PS1 siRNA最佳干扰时间是48h23
2. PS1表达下调影响PS2的表达23-25
图版与说明25-30
第二章 Presenipnl缺失介导PARL-OPA1相关的线粒体凋亡途径30-47
摘要30
前言30-32
材料和策略32-36
结果36-37
1. PS1缺失对PARL和OPA1基因表达的影响36-37
2. PS1缺失引起线粒体途径细胞凋亡的表征37
讨论37-41
1. PS1缺失引起PARL和OPA1线粒体水平的表达下调37-39
2. PS1缺失引起线粒体途径的细胞凋亡39-41
图版与说明41-47
第三章 文献综述47-52
一、阿尔茨海默症神经退行性变化机制探讨的新进展47-48
二、线粒体和细胞凋亡48-52