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摘要：二十余年来,肿瘤的抗体靶向治疗进展迅速。曲妥珠单克隆抗体(Trastuzumab)和利妥昔单克隆抗体(Rituximab)分别被用于靶向性治疗乳腺癌转移和非何杰金式淋巴瘤；并取得了良好的临床治疗效果。肿瘤靶向治疗的关键在于发现肿瘤特异性抗原。然而,已获鉴定的肿瘤特异性抗原数量较少,这大大限制了运用抗体进行肿瘤靶向治疗的进展。除了抗体,肿瘤浸润性T细胞表面的T细胞受体(T cell receptor, TCR)也能特异地识别肿瘤抗原,这使之成为肿瘤靶向治疗的理想候选者。据报道,运用TCRαβ进行肿瘤靶向治疗的探讨已取得了初步的进展。TCRγ9δ2在TCR缺失的JRT3-T3.5细胞中表达,能够赋予后者识别和杀伤肿瘤细胞的能力,表明TCRγ9δ2在γ9δ2T细胞对肿瘤细胞的杀伤中起着关键性作用。对肿瘤细胞的特异识别使TCRγ9δ2可能像抗体一样运用于肿瘤的靶向治疗。更重要的是,与TCRαβ相比,TCRγδ的抗原识别不受主要组织相容性复合物(Major histocompabipty complex, MHC)限制,其抗原识别谱可能更广。由此,TCRγδ运用于肿瘤靶向治疗可能也具有一定优势。本课题组致力于探讨TCRγ9δ2在肿瘤靶向治疗中的作用。在前期工作中,本组在人卵巢上皮癌浸润性T淋巴细胞中获得了一个优势TCRδ2链互补决定区3(complementary determining region3, CDR3)序列,将其命名为OT3。实验证明,TCRγ9δ2(OT3)是卵巢癌反应性的特异性TCR。用OT3取代抗体重链CDR3区,构建的CDR3δ(OT3)移植性抗体,保留了其与多种肿瘤细胞的结合特性,但亲和力较弱。为了获得既具有对肿瘤抗原的高亲合特性,又具有抗体生物学功能的融合蛋白,我们将TCRγ9δ2(OT3)的完整胞外段或可变区分别与人IgGl重链恒定区连接起来,构建了三种TCRγδ-Ig融合蛋白,即TCRγ9δ2(OT3)-Fc, TCRVδ2(OT3)-Fc和TCRVδ2(OT3)H/Vγ9Lλ。体外结合实验的结果表明,三种融合蛋白中,TCRγ9δ2(OT3)-Fc与卵巢癌细胞系和组织的结合能力最强。由此,本探讨的第一部分工作,主要探讨了TCRγ9δ2(OT3)-Fc的肿瘤结合能力和体内外抗卵巢癌效应。我们发现,除了卵巢癌,TCRγ9δ2(OT3)-Fc在体外能结合其他多种肿瘤细胞系,提示其可能具有广谱肿瘤靶向性;体外杀伤实验结果显示,TCRγ9δ2(OT3)-Fc的加入可以显著增强人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)对卵巢癌细胞系SKOV3和ES-2细胞的杀伤作用,并具有剂量依赖的特性。体内实验结果显示,在人卵巢癌移植瘤裸鼠模型中,与PBS对照组相比,TCRγ9δ2(OT3)-Fc能够有效抑制肿瘤生长,并延长荷瘤裸鼠的存活期。这些数据表明,TCRγ9δ2(OT3)-Fc融合蛋白保留了TCRγδ的抗原识别特性,同时也兼具抗体Fc段介导的效应功能,将其运用于卵巢癌的靶向治疗是可行的。而且,由于TCRγ9δ2(OT3)-Fc能结合多种肿瘤细胞系,具有潜在的广谱肿瘤靶向性,有望扩大肿瘤靶向治疗的运用范围。本探讨的第二部分工作,主要是功能性抗人TCRγδ抗体的探讨,以期用其扩增γδT细胞,运用于肿瘤的过继免疫治疗。在肿瘤免疫中,γδ T细胞对肿瘤抗原的识别不具MHC限制性,能分泌大量干扰素-γ(Interferon-γ, IFN-γ),且能杀伤多种肿瘤细胞系,以而具有用于肿瘤过继免疫治疗的潜能。由于γδ T细胞仅占外周血T细胞的1～10%,获取足够数量且有相应生物学功能的γδ T细胞,成为制约其运用于过继免疫治疗的瓶颈。目前获得用于过继免疫治疗的γδ T细胞的策略有两种,一种是磷酸抗原刺激增殖,如4-羟基-3--2-已烯基-4-焦磷酸(HMBPP),另一种是固相化抗体体外扩增；两种策略均需联合白细胞介素-2(Interleukin-2, IL-2)。本课题组重点探讨固相化抗体体外扩增的γδ T细胞的过继免疫治疗。但是由于目前利用的抗TCRγδ单克隆抗体是鼠源的,有产生人抗鼠抗体(human anti-mouse antibody, HAMA)反应的潜在危险,因而在临床治疗上受到一定限制。由此,本论文第二部分的工作,旨在构建稳定分泌抗人TCRγδ单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并在此基础上,构建人源化的抗人TCRγδ抗体或单链抗体(single chain variable fragment, ScFv)。通过对人源化抗体或单链抗体的生物学功能进行浅析,以验证其能否替代鼠源亲本抗体,用于制备过继免疫治疗的γδT细胞制剂。首先,我们以TCRγ9δ2(OT3)-Fc为免疫原免疫BALB/c小鼠,用常规杂交瘤技术获得能稳定分泌抗人TCRγδ抗体的杂交瘤细胞株。并用固相化抗体体外扩增的策略,筛选到分泌能体外扩增γδT细胞的单抗的杂交瘤细胞株--G5-4。其后,通过RT-PCR法,以杂交瘤细胞株G5-4的cDNA中分别扩增获得抗体的轻重链的可变区基因；并分别构建了嵌合抗体的表达质粒G5-4-pAc-κ-CH3和单链抗体的表达质粒G5-4ScFv-pET22b(+)。嵌合抗体和单链抗体分别在在昆虫杆状病毒表达系统和大肠杆菌TransB(DE3)中得到成功表达。最后,重点对单链抗体G5-4ScFv的生物学功能进行了浅析。结果表明,单链抗体G5-4ScFv能与TCRγδ特异结合；固相化G5-4ScFv能刺激人PBMC中γδT细胞增殖,2周时其纯度可达90%；扩增得到的γδT细胞能有效杀伤肿瘤细胞系,如Daudi细胞；并在刺激时能有效分泌干扰素-γ(INIFN-γ)和TGF-α。提示,本实验成功构建并表达了具有生物学活性的抗人TCRγδ单链抗体G5-4ScFv,为进一步探讨其用于制备肿瘤过继免疫治疗的细胞制剂奠定了基础。综上所述,本论文的探讨有以下成果：1.我们构建并表达了具有较高亲和力的TCRγ9δ2(OT3)-Fc融合蛋白,该蛋白兼具TCRγδ的抗原识别特性和抗体的效应功能。2. TCRγ9δ2(OT3)-Fc在体内外均体现出抗卵巢癌的功能,提示有运用于卵巢癌靶向治疗的前景。3.由于TCRγ9δ2(OT3)-Fc的潜在广谱肿瘤识别特性,由此,它具有运用于多种肿瘤靶向治疗的可能性。4.成功构建了稳定分泌抗人TCRγδ单克隆抗体的杂交瘤细胞株。5.构建并表达了人源化的抗人TCRγδ抗体或单链抗体。6.单链抗体G5-4ScFv能与人TCRγδ特异结合,固相化后能有效刺激人PBMC中γδT细胞增殖,有望替代鼠源抗体用于制备过继免疫治疗的γδT细胞制剂。关键词：TCRγδ-Ig融合蛋白论文肿瘤靶向治疗论文抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)论文移植瘤裸鼠模型论文单克隆抗体论文HAMA反应论文单链抗体论文
目录3-4
中文摘要4-7
Abstract7-11
英文缩略词表11-15
前言15-18
第一部分 TCRγδ-Ig融合蛋白抗人卵巢癌活性的探讨18-40
技术路线18-19
材料19-24
策略24-31
结果31-40
讨论40
第二部分 功能性抗人TCRγδ抗体及单链抗体的制备和鉴定40-83
技术路线45-46
材料46-55
策略55-65
结果65-80
讨论80-83
全文结论83-84