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摘要：第一部分Aβ1-42对细胞内α-syn表达、聚集、降解的影响及与Calpain-1的联系目的：通过转染人α-突触核蛋白(α-synuclein, α-syn)A53T突变基因的PC12细胞(A53T-PC12细胞)模型,探讨β-淀粉样蛋白1-42片段(Amyloid-β1-42,Aβ1-42)对细胞内α-syn表达、聚集、降解的影响,及可能的机制。策略：予Aβ1-42干预A53T-PC12细胞,采取MTT法检测细胞活性转变,观察细胞内活性氧自由基(Reactive oxygen species, ROS)水平变化；并予Aβ1-42和常用抗氧化剂维生素C(Vitamin C, VitC)同时干预(Aβ1-42+VitC)细胞,观察VitC对Aβ1-42介导的损伤是否有拮抗作用。特异性α-syn抗体及硫磺素S(Thioflin S,ThS)双重免疫荧光染色直接观察Aβ1-42、Aβ1-42+VitC干预后细胞内a-syn聚集情况。通过Western blot半定量检测不同干预后细胞内a-syn表达及聚集的转变,同时观察细胞内Calpain-1水平变化,并浅析a-syn聚集体量与Calpain-1水平的相关性。结果：①Aβ1-42干预后细胞内ROS水平增加,细胞活性降低；且细胞活性变化与Aβ1-42浓度、作用时间相关。VitC可拮抗Aβ1-42介导的细胞损伤。②随着Aβ1-42干预时间延长(24、48、72h),A53T-PC12细胞内a-syn表达量逐渐增加,聚集体逐渐增加。Aβ1-42干预72h后细胞内a-syn总量与干预48h相比无显著差别,而a-syn聚集体量出现显著统计学差别,P0.05。③Aβ1-42干预后推动A53T-PC12细胞内α-syn聚集,且α-syn聚集体内β折叠结构增加。经不同抗原表型抗体结合反应后发现部分α-syn聚集体缺少130-140氨基酸片段,即部分聚集体由C端截断a-syn片段的构成。④根据Western blot结果提示,VitC可拮抗Aβ1-42推动α-syn聚集的历程,降低α-syn聚集体谱带密度；5uM Aβ1-42干预48h后A53T-PC12细胞内a-syn聚集体相对值为(1.36±0.22),而与VitC共同干预后谱带密度相对值为(0.37±0.16),两者有统计学差别,P0.05。⑤Aβ1-42干预后,细胞内Calpain-1水平降低,同时聚集体的量较PBS组升高,p0.05；而予VitC抗氧化干预后Calpain-1水平升高,同时细胞内聚集体的量较Aβ1-42单独干预时降低,p0.05。结论：Aβ1-42对A53T-PC12细胞产生氧化损伤,推动细胞内α-syn表达、聚集；同时降低Calpain-1水平,减少细胞内α-syn降解。第二部分Aβ1-42对细胞内α-syn磷酸化的影响及与CK2的联系目的：了解Aβ1-42对A53T-PC12细胞内α-syn磷酸化水平、聚集程度的影响及可能的促磷酸化机制。策略：分别予H2O2、PBS、Aβ1-42干预A53T-PC12细胞,通过双重免疫荧光染色观察细胞内α-syn聚集情况；并观察酪蛋白激酶2(Casein kinase2, CK2)特异性抑制剂与Aβ1-42同时干预后细胞内α-syn聚集情况变化。Aβ1-42干预A53T-PC12细胞后Western blot半定量浅析细胞内a-syn Ser129位点磷酸化(Pa-syn)及α-syn聚集体水平变化,并同时观察细胞内CK2的变化。予CK2特异性抑制剂与Aβ1-42同时干预后,观察A53T-PC12细胞内CK2、Pa-syn及a-syn聚集体的变化。结果：①免疫荧光染色提示Aβ1-42干预后推动A53T-PC12细胞内a-syn聚集；而Aβ1-42与CK2酶抑制剂同时干预后细胞内a-syn聚集减少。②Aβ1-42单独干预后细胞内CK2水平升高(p0.01),Pα-syn及α-syn聚集体较PBS干预组升高(p0.001,p0.05)；而Aβ1-42与CK2特异性抑制剂同时干预后细胞内CK2水平降低(p0.05),同时细胞内Pa-syn水平及聚集体的量较Aβ1-42单独干预时降低(p0.01,p0.05)。结论：Aβ1-42增加细胞内CK2水平,推动A53T-PC12细胞内a-syn Ser129位点磷酸化、a-syn聚集历程。全文结论1、Aβ1-42介导的氧化损伤作用,推动A53T-PC12细胞内ROS产生,抑制细胞活性；2、Aβ1-42推动A53T-PC12细胞内α-syn表达、聚集,影响α-syn聚集体构型变化；部分α-syn聚集体由C端截断的α-syn片段构成；3、Aβ1-42降低了细胞内Calpain-1水平,减少了A53T-PC12细胞内a-syn聚集体及单体的降解；4、Aβ1-42增加了细胞内CK2的表达,推动A53T-PC12细胞内α-syn Ser129位点磷酸化,以而推动α-syn的聚集。关键词：β-淀粉样蛋白_(1-42)论文α-突触核蛋白论文聚集体论文磷酸化论文帕金森病论文
中文摘要4-8
Abstract8-12
前言12-14
第一部分 Aβ_(1-42)对细胞内α-syn表达、聚集、降解的影响及与Calpain-1的联系14-31
材料和策略14-21
实验结果21-28
讨论28-31
第二部分 Aβ_(1-42)对细胞内α-syn磷酸化的影响及与CK2的联系31-38
材料与策略31-33
实验结果33-37
讨论37-38
全文结论38-39