高低代次高致病性猪繁殖和呼吸综合征病毒Marc145细胞适应性差异

摘要3-4

ABSTRACT4-5

插图和附表清单5-6

英文缩写表6-7

目录7-9

章 引言9-20

1.1 高致病性蓝耳病的研究进展9-12

1.1.1 HP-PRRSV的遗传学分析9-10

1.1.2 HP-PRRSV致病力的研究10

1.1.3 检测方法10-11

1.1.4 HP-PRRSV疫苗研究11-12

1.2 影响PRRSV感染宿主细胞的因素12-16

1.2.1 细胞受体12-14

1.2.2 胞内大分子物质14-15

1.2.3 细胞因子的作用15

1.2.4 小结15-16

1.3 实验研究内容与主要方法16-19

1.3.1 实验研究内容16

1.3.2 实验主要方法-消减抑制杂交技术16-19

1.4 研究的目的与19-20

章 PRRSV GD株不同代次间Marc-145细胞适应性比较与基因组全序列的测定20-34

2.1 20-22

2.1.1 细胞与毒株20

2.1.2 生物试剂20-21

2.1.3 溶液配制21

2.1.4 主要仪器设备21-22

2.2 实验方法22-26

2.2.1 Marc-145细胞的培养22

2.2.2 PRRSV GD株的体外传代22

2.2.3 PRRSV GD株体外传代各代次TCID_(50)值的测定22

2.2.4 PRRSV GD株体外传代各代次CPE产生时间的观察22-23

2.2.5 总RNA的提取23

2.2.6 RT-PCR23-25

2.2.7 PCR产物电泳验证25

2.2.8 PRRSV GD株各代次基因组全序列测序结果的分析25

2.2.9 PRRSV GD株基因组全序列5'UTR的序列分析25-26

2.3 实验结果26-32

2.3.1 PRRSV GD株体外传代各代次TCID_(50)值26-27

2.3.2 PRRSV GD株体外传代各个代次CPE时间观察结果27-28

2.3.3 PCR扩增产物电泳检测结果28

2.3.4 高低代次PRRSV GD株基因组全序列碱基突变分析28-30

2.3.5 高低代次PRRSV GD株基因组全序列氨基酸突变分析30-32

2.3.6 PRRSV GD传代毒株5'UTR的序列分析32

2.4 讨论32-34

章 Marc-145细胞基因转录差异文库的建立34-50

3.1 实验34-37

3.1.1 细胞与毒株34

3.1.2 生物试剂34-35

3.1.3 溶液配制35-36

3.1.4 主要仪器设备36-37

3.2 实验方法37-44

3.2.1 Marc-145细胞的培养37

3.2.2 PRRSV GD株5代与100代感染Marc-145细胞CPE产生时间观察37

3.2.3 mRNA的提取37-38

3.2.4 mRNA链cDNA的合成38

3.2.5 链cDNA合成38-39

3.2.6 双链cDNA末端修饰39

3.2.7 双链cDNA的RsaⅠ酶切消化39

3.2.8 接头的制备39-40

3.2.9 消化产物与接头连接40

3.2.10 消减抑制杂交40-41

3.2.11 套式PCR扩增差异基因41-42

3.2.12 PCR产物与T载体连接42

3.2.13 构建载体的转化与克隆42-43

3.2.14 检测与测序43

3.2.15 构建文库的序列分析43-44

3.3 实验结果44-48

3.3.1 PRRSV GD体外传代毒株5代与100代感染Marc-145细胞之后CPE产生情况44

3.3.2 RsaⅠ酶切图44-45

3.3.3 PCR检测图45-47

3.3.4 差异基因文库的构建47-48

3.4 讨论48-50

章 50-51

4.1 实验总结50

4.2 下一步工作设想50-51