摘要6-8
Abstract8-17
第一章 绪论17-34
1.1 PRRS的病原、分类与流行17-19
1.2 PRRSV的致病机理19-20
1.3 PRRSV的基因组结构与复制20-21
1.4 PRRSV的编码蛋白及其功能21-24
1.4.1 PRRSV非结构蛋白21-23
1.4.2 PRRSV结构蛋白23-24
1.5 PRRSV遗传变异24-27
1.5.1 非结构蛋白的变异24-26
1.5.2 结构蛋白的变异26
1.5.3 非编码区序列变异26-27
1.6 PRRSV毒力因子27-29
1.6.1 Nsp2基因变异与PRRSV毒力的联系27-28
1.6.2 其他毒力相关因子28-29
1.7 PRRSV检测29-30
1.7.1 病毒分离29
1.7.2 核酸检测29
1.7.3 抗原抗体检测29-30
1.8 反向遗传系统在探讨PRRSV基因功能及进展新型疫苗和病毒载体上的运用30-33
1.8.1 探讨结构蛋白的功能30-31
1.8.2 探讨非编码区和非结构蛋白的功能31
1.8.3 在探讨新型疫苗和基因载体的上的运用31-33
1.9 探讨的目的作用33-34
第二章 PRRSV TJ株和TJM株NSP2基因特性的探讨34-47
2.1 材料和策略34-36
2.1.1 毒株和细胞34
2.1.2 载体、菌株及试剂34-35
2.1.3 引物的设计与合成35
2.1.4 病毒RNA制备35
2.1.5 RT-PCR反应35
2.1.6 PCR产物的克隆与鉴定35-36
2.1.7 序列测定及浅析36
2.2 结果36-44
2.2.1 RT-PCR扩增结果36-37
2.2.2 RT-PCR产物的克隆及鉴定37-38
2.2.3 重组质粒的测序及比对结果38-39
2.2.4 缺失的120 aa的蛋白序列结构浅析39-40
2.2.5 PRRSV TJ株F3代和TJM-F92的Nsp2蛋白二级结构预测40-41
2.2.6 PRRSV TJ株、TJM和VR-2332的Nsp2基因RNA序列结构比较41-42
2.2.7 鉴别检测TJM与HP-PRRSV42
2.2.8 6对PRRSV强弱毒Nsp2基因氨基酸比对及进化树构建42-44
2.3 结论与讨论44-47
第三章 稳定细胞系的建立及NSP2蛋白对PRRSV复制的影响47-57
3.1 材料和策略47-49
3.1.1 病毒、细胞、菌种和质粒47
3.1.2 试剂47
3.1.3 PRRSV TJ株和TJM株Nsp2全基因表达片段的克隆测序47-48
3.1.4 重组真核表达载体的构建48
3.1.5 G418最佳工作浓度的确定48
3.1.6 重组真核表达载体的转染与细胞系的筛选48
3.1.7 Nsp2在Marc-145细胞系中的表达检测48-49
3.1.8 细胞生长曲线的绘制49
3.1.9 PRRSV在细胞系上增殖的测定49
3.2 结果49-55
3.2.1 PRRSV Nsp2全基因表达片段的克隆49-50
3.2.2 重组真核表达载体的构建与鉴定50
3.2.3 G418最佳工作浓度的确定50-51
3.2.4 表达Nsp2细胞系的筛选51
3.2.5 PRRSV Nsp2基因在Marc-145细胞中的表达检测51-54
3.2.6 细胞生长曲线54
3.2.7 PRRSV在细胞系上的增殖54-55
3.3 讨论55-57
第四章 用NSP2基因小干扰RNA抑制PRRSV复制的探讨57-67
4.1 材料与策略57-59
4.1.1 病毒、细胞和质粒57
4.1.2 引物设计与合成57-59
4.1.3 siRNA的筛选及PRRSV TJ株Nsp2蛋白基因ShRNA表达载体构建59
4.1.4 shRNA表达载体的转染及病毒的感染59
4.1.5 半定量RT-PCR检测shRNA表达载体抑制效果59
4.1.6 shRNA干扰后病毒滴度测定59
4.2 结果59-65
4.2.1 shRNA的扩增、测序及表达载体的构建59-60
4.2.2 shRNA表达载体转染效率及对PRRSV的抑制作用60-62
4.2.3 半定量RT-PCR检测PRRSV Nsp2 mRNA相对表达量62-64
4.2.4 病毒滴度测定64-65
4.3 讨论65-67
第五章 高致病性PRRSV强弱毒全长感染性克隆的构建67-86
5.1 材料和策略67-73
5.1.1 病毒、细胞和质粒67
5.1.2 试剂67-68
5.1.3 全长构建对策及引物的设计合成68
5.1.4 病毒RNA提取及RT-PCR反应获得cDN段68
5.1.5 病毒cDNA的克隆和测序68
5.1.6 全长cDNA克隆的构建及鉴定68-69
5.1.7 全长cDNA克隆的转染69
5.1.8 重组病毒的检测69-70
5.1.9 病毒多步生长曲线的绘制70
5.1.10 病毒细胞半数感染量(TCID_(50))测定70-73
5.2 结果73-83
5.2.1 PRRSV TJ株和TJM株全基因组序列分段扩增及测序结果73-74
5.2.2 PRRSV TJM株全基因组序列与亲本毒TJ株全序列的比较74-75
5.2.3 遗传标记的引入75-76
5.2.4 全长cDNA克隆获得76-77
5.2.5 PRRSV全长cDNA序列的测序结果77-78
5.2.6 全基因比对78-79
5.2.7 重组PRRSV的拯救79
5.2.8 重组PRRSV的鉴定79-81
5.2.9 重组病毒生长动力学81-83
5.3 讨论83-86
第六章 全文结论86-87