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摘要：猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍以及仔猪呼吸道疾病为特点的传染性疾病。该病自发现以来给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。近几年来我国大部分地区夏秋季出现猪的高热病,农业部2007年确定引起高热病的主要病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株。GP5蛋白是PRRSV主要囊膜蛋白之一,也是诱导机体产生免疫反应的主要保护性抗原蛋白。蛋白质结构决定功能,病毒囊膜蛋白拓扑结构探讨是一项基础性工作。PRRSV-GP5拓扑结构的探讨,对深入了解PRRSV与宿主细胞相互作用,研制高效PRRS疫苗都具有积极作用。本论文针对高致病性PRRSV(江西a1),以四个方面对GP5蛋白进行拓扑结构探讨,获得了初步的探讨结果。一、GP5蛋白拓扑结构预测通过hmmtop、TMHMM-2.0、MemBrain和DAS等软件浅析,GP5蛋白共有三个主要集中疏水片段,分别是Aa8-27、Aa63-82和Aa107-126。推测这三段可能是跨膜片段,GP51-33Aa为信号肽,翻译后发生剪切,推测为后两段为跨膜片段,AB表位和C末端是GP5蛋白的两个重要抗原表位区,所以推测30-62位于病毒囊膜的外侧,83-106位于病毒囊膜内侧,而127以后位于囊膜的内侧。二、GP5蛋白亲水区特异性抗体制备根据以上预测结果,分别化学合成GP5蛋白的四个亲水区肽段MLGKCLTACCCSRLLFLWCIVPFYLC (Aal-27,编号为IL36)、VLVN ASNNNSSHIQ LIYNLC (Aa27-45,编号IG45)、TTSHFLDTVGLATVST AGYYHGRYC (Aa83-106,编号为IY45)和TPLTRVSAELWGRL(Aal87-200,编号为IL-35)。将合成肽用白油佐剂乳化后,免疫ICR小白鼠,ELISA检测血清效价并验证特异性,最后采血分离血清备用。三、免疫学策略探讨GP5蛋白拓扑结构运用免疫学策略探讨GP5蛋白在细胞中和病毒粒子中的拓扑结构。将PRRSV接种Marc-145细胞,细胞固定后,利用不同去垢剂处理(Tritonx-100和digitonin),进行间接免疫荧光实验,结果显示AB表位和C末端两个重要抗原表位区位于细胞内质网腔的内侧(lumen),即病毒囊膜的外侧。通过超离纯化病毒粒子后,利用蛋白酶k水解,进行的western-blotting试验,结果也表明,AB表位和C端也位于病毒囊膜的外侧,与预测结果相符合。(四)融合蛋白法探讨GP5蛋白膜拓扑结构运用融合蛋白策略,将禽流感血凝素标签与GP5融合探讨GP5膜拓扑结构。利用重叠延伸PCR技术将HA标签(YPYDVPDYA)分别插入到GP5的N端、50位、95位和C端,构建重组真核表达载体pcDNA3.0,转染293T细胞后,利用HA抗体进行间接免疫荧光试验。结果显示：N端信号肽发生剪切,50位和C端位于细胞内质网腔内侧,而95位于细胞质一侧。与以上病毒粒子免疫学检测结果相一致。关键词：猪繁殖与呼吸道综合征病毒论文囊膜蛋白论文GP5论文拓扑结构论文
摘要3-5
ABSTRACT5-8
符号说明8-10
文献综述10-25
第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒探讨进展10-17
1 猪繁殖与呼吸综合征病毒分子结构特点10-13
2 猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫特点13-15
3 PRRS V结构生物学探讨进展15-17
第二章 蛋白膜拓扑学探讨17-25
1 蛋白膜拓扑学探讨内容17
2 膜蛋白拓扑取向的基本原理17-18
3 蛋白膜拓扑学探讨常用的策略18-23
4 影响蛋白拓扑取向的因素23-25
实验部分25-64
第三章 PRRSV GP5膜拓扑结构预测25-33
1 试验材料25-26
2 试验策略26-28
3 试验结果28-30
4. 讨论30-33
第四章 PRRSV GP5蛋白多肽特异性抗体制备33-39
1 试验材料33-34
2 试验策略34-35
3 试验结果35-37
4 讨论37-39
第五章 免疫学策略探讨PRRSV GP5膜拓扑结构39-48
1 试验材料40
2 策略40-43
3 结果43-47
4 讨论47-48
第六章 融合蛋白法探讨PRRSV GP5拓扑结构48-64
1 材料48-49
2 策略49-57
3 结果57-62
4 讨论62-64
全文总结及展望64-66