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摘要：肠球菌通常为条件致病菌。当发生异位寄生时,肠球菌可引起多种感染,如泌尿系感染、心内膜炎、脑膜炎、败血症、伤口感染、呼吸道感染等,严重的可危及生命。与其他革兰氏阳性菌相比,肠球菌属具有更强的天然耐药性,且易被抗生素诱导产生新的耐药性。近年来,免疫抑制剂在临床治疗中广泛应用,以及广谱抗生素的过度使用及不合理应用等因素导致肠球菌属感染和耐药性增多,已院内感染的主要致病菌。耐万古霉素肠球菌(Vancomycin-Resistant Enterococci,VRE)的出现,临床治疗耐药菌感染面临着更大的困难。VRE的耐药基因可质粒转移给其他致病菌,近年来报道的由VRE导致的耐万古霉素金葡萄球菌( Vancomycin-Resistant Staphylococcus aureus,VRSA)的出现,人们对VRE的耐药机制更加关注。对临床分离到的耐万古霉素粪肠球菌(Enterococcus Faecaps V309,EF V309)菌株了分型鉴定,特性研究及比较蛋白质组学研究,阐明了粪肠球菌对万古霉素的耐药机制,并首次对万古霉素对耐药基因诱导的特异性和可逆性及万古霉素诱导下菌体蛋白磷酸化修饰作用了研究,为控制耐药基因的传播和指导临床用药奠定基础。,利用蛋白质双向电泳技术,对万古霉素耐药粪肠球菌标准菌株EFV583及临床分离耐万古霉素粪肠球菌菌株EFV309在加药诱导前后及加药后去除药物等条件下的菌体蛋白表达情况了对比分析。ImageMaster软件分析各组电泳图谱,找出差异蛋白点,对表达量差异3倍以上的蛋白质点质谱鉴定。利用多功能串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS),共鉴定到57个有的蛋白,其中大多数蛋白质点的pI和分子量与理论值相符,但也有一些存在差异。本研究在V309中鉴定到20个上调蛋白、6个下调蛋白及4个发生位移的蛋白,在V583中鉴定到28个上调蛋白、8个下调蛋白及1个发生位移的蛋白。利用半定量RT-PCR在反转录上也验证了这些蛋白编码基因表达量的相应变化。其中包括已知耐药蛋白VanA、VanX(V309)及VanB、VanXB(V583),它们在万古霉素诱导下均有20倍以上的上调表达,且存在翻译后修饰。值得关注的是在V309中VanA、VanX在未经万古霉素诱导时也表达,这与V583不同,两者耐药的分子机制不尽相同。,还鉴定到一些耐药机制尚不十分明确的蛋白,包括毒力因子(EF2076、EF0577、EF3256)、应激蛋白(EF1308、EF1744、EF0080)、代谢蛋白、翻译蛋白、接合转移蛋白及一些检测想蛋白。这些蛋白可能与细胞粘附机制、耐药性的转移与表达、耐药基因的与基因重组修复、菌体内酶的活化与抑制有密切关系。对这些蛋白在菌体中可能发挥的功能了分析。在对万古霉素对耐药基因诱导的特异性的研究中,将EFV583、EFV309菌株在万古霉素诱导培养8h、12h、16h后,药物诱导时间的延长,耐药蛋白VanA、VanB、VanX的表达量也随之升高,了药物对这些蛋白的诱导是特异性的。在对万古霉素对耐药基因诱导的可逆性研究中,将EFV583、EFV309菌株在不加和加万古霉素诱导培养6h后,分别去除和不去除万古霉素诱导,继续培养6h。结果当药物诱导因素去除后,在诱导培养时表达量升高的耐药蛋白VanA、VanB、VanX表达量又降低,了药物对这些蛋白的诱导是可逆性的。RT-PCR的检测,证实耐药蛋白编码基因在各个条件下表达量的变化与对应蛋白的变化一致。,有6个蛋白可能存在翻译后修饰(Gpm、Ldh、Gap2、RpsB、EF2076、EF3256)。菌体中存在的蛋白翻译后修饰,通常是氨基酸修饰或肽段断裂引起的蛋白电荷或分子量的改变,表现为蛋白点丰度或位置的迁移。本研究中发现V583及V309分别有1个及4个蛋白在万古霉素诱导培养后发生了位移,即Esa (EF2076)及Pgm1 (EF0195)、Ldh (EF0255)、Gap-2 (EF1964)、RpsB (EF2398),推测可能是磷酸化修饰或其他修饰引起分子量及等电点变化的结果。利用Pro-Q染色及Western Blots技术共鉴定到3个磷酸化蛋白Ldh、Gap-2、cAD1,PHOSIDA数据库同源性比对,确定了其可能的磷酸化位点。这也是首次在粪肠球菌中鉴定到磷酸化蛋白。其中性激素cAD1前体脂蛋白(EF3256)有5个同源异构体,Pro-Q染色发现它存在的磷酸化翻译后修饰,且在经万古霉素诱导培养后的菌体中其磷酸化均增强,Western Blot检测证实在EF3256中同时存在丝氨酸和苏氨酸的磷酸化。但性激素cAD1前体脂蛋白既已知的磷酸化功能域(Phosphorylation motif, PMF)也在磷酸化肽段数据库(PHOSIDA)中找到其同源性结构。已知耐药因子的传播归因于性激素依赖的质粒转移,但有关性激素cAD1前体脂蛋白的磷酸化及其在细胞信号调节中的作用都未有过报道,因此对其功能研究。在粪肠球菌V583中,性激素cAD1前体脂蛋白由309个氨基酸组成,在信号序列中有一个22个氨基酸组成的带有半胱氨酸残基的脂质区,的8个氨基酸构成了cAD1,位于脂蛋白信号序列之后的Sec依赖的输出部位为检测定的信号肽切割位点。另一种将性激素cCF10转移至胞内的性激素转运蛋白(OppA-pke protien)在万古霉素诱导的V309菌株中上调,因此胞外的cAD1应是与OppA-pke膜表面脂蛋白提高了受体菌的感受性,并经由ABC肽转运系统吸收。这暗示了万古霉素能增加质粒发生接合转移的可能性,并增强对外源细菌的感受性。推测V583和V309中磷酸化性激素cAD1前体脂蛋白可能是一种激活,在性激素在细胞信号传导中起作用。诱导毒力基因表达及质粒的接合转移,万古霉素使粪肠球菌更容易或传播质粒,尤其对于带有耐药基因的菌株。粪肠球菌的耐药性,尤其是对万古霉素的性耐药是与其基因组特征紧密的。,可能已有估量的毒力及耐药移动元件被粪肠球菌基因组整合。中对粪肠球菌V583和V309的比较蛋白质组学研究丰富了对其生理特性的研究,同时也支持由Paulsen等的移动DNA元件作为万古霉素耐药性的转移因子及糖肽类耐药分子机制的检测设。更的是,该研究确定了万古霉素耐药蛋白,并且证实了一些在万古霉素调节作用下差异性表达的抗生素耐药蛋白激发了内源信号调整因子、粘附因子及代谢基因的表达。这一系列反应都使得粪肠球菌在万古霉素压力下继续生存和引起发病。本研究结果对揭示粪肠球菌耐药的分子机制,从而找到相应的控制策略具有的。关键词：肠球菌论文万古霉素耐药论文比较蛋白质组学论文磷酸化蛋白论文
缩略词表5-7
摘要7-10
Abstract10-14
前言14-18
章 耐万古霉素肠球菌(VRE)的鉴定分型18-28
一、与方法18-20
二、结果20-25
三、讨论25-28
章 万古霉素诱导下VRE 的比较蛋白质组学研究28-54
一、与方法28-34
二、结果34-50
三、讨论50-53
四、小结53-54
章 万古霉素诱导下VRE 菌体蛋白磷酸化修饰的研究54-65
一、与方法54-57
二、结果57-60
三、讨论60-65
总结65-66