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摘要：嗜水气单胞菌是革兰氏阴性杆菌，弧菌科气单胞菌属，可引起软体动物、淡水鱼类、两栖类、爬行类、鸟类及哺乳动物等多种动物全身性败血症或局部感染，并常致动物死亡。嗜水气单胞菌对人也有致病性，可引起人的急性胃肠炎、败血症及伤口感染、中耳炎、腹膜炎等。，嗜水气单胞菌作为致病微生物的地位已确定，并且当代公共卫生关注的对象。嗜水气单胞菌的菌株所产生的外毒素是的致病因子。已确定的外毒素有气溶素(aerolysin)、溶血素(hemolysin)、溶血毒素(hemolytic toxin)和细胞毒性肠毒素(cytolytic enterotoxin)等。外毒素虽名称各异，但其基因结构有较高的同源性，被是一类毒素基因，关于嗜水气单胞菌的外毒素，国际逐渐公认其名称为气溶素(Aer毒素)。嗜水气单胞菌Aer毒素的致病性，因而毒素的检测在嗜水气单胞菌的诊断、流行病学调查及公共卫生检测、检疫等具有作用。本研究选择嗜水单胞菌Aer毒素为研究对象，分析国内致病株该基因的结构，构建原核表达载体，并在E.cop BL21(DE3)中表达。研究重组Aer毒素和天然Aer毒素的抗原特性，为建立基于重组Aer毒素的免疫检测方法和Aer毒素的研究奠定基础。该领域国外研究热点在嗜水气单胞菌毒素的基因组结构、毒力因子基因克隆和序列比较以及毒素蛋白的表达和致病机理等。国内，鱼类暴发性流行病，对嗜水气单胞菌的表型分析、毒素原性和疫苗制备等做了工作。在嗜水气单胞菌的检测分型上，除了常规分离培养、血清学检测外，基因探针、PCR、RAPD等技术已应用到外毒素的检测和分型上，但对有关毒力因子的基因结构特征及其重组毒素的表达、纯化及抗原性分析的研究还很少。本研究选择国内嗜水单胞菌分离株AHCS02产生的Aer毒素为研究对象，分析其基因的结构，构建原核表达载体，并在E.cop BL21(DE3)中表达，并研究重组Aer毒素和天然Aer毒素的抗原特性。旨在建立嗜水气单胞菌基于重组Aer毒素的免疫检测方法。Aer毒素基因的克隆和序列分析Genbank中嗜水气单胞菌Aer毒素基因的序列(注册号为M16495)，设计扩增编码Aer毒素成熟蛋白基因的引物，以国内嗜水气单胞菌分离株AHCS02(分离自吉林省四家子水库的病鱼)为模板，PCR扩增Aer毒素编码成熟蛋白的基因序列，PCR产物与pMD18-T载体连接，构建重组质粒pMD18-T-aer，酶切鉴定和序列测定。酶切鉴定及测序结果：所得片段大小为1332bp。用DNA TOOLS和BLAST分析：该序列与M16495比较，二者的同源性为92％，有108个碱基不同。在108个碱基中，有76个碱基变异未引起编码氨基酸的变异，32个碱基变异引起了19个氨基酸的变异，氨基酸的变异主要在422～436个氨基酸之间，其间有8个氨基酸发生改变，其中435～437个氨基酸残基之间丢失一个子，所得序列共编码443个氨基酸，氨基酸序列与M16495的同源性为95．5％。原核表达载体的构建及表达经酶切鉴定和序列测定分析后，将pMD—18T—tier质粒DNA经EcaR I和妇』I双酶切后Aer‘毒素基因片段，与经过相同酶切的pET28b连接后，转化克隆菌DH5 Q，提取重组质粒DNA，经酶切鉴定和测序后，将重组质粒pET28b—aer转化表达宿主菌E cD』j BL21(DE3)中．用终浓度为llllmOl／L的IPTG诱导培养重组表达菌。取诱导培养的重组表达菌和对照菌做菌体裂解物外源基因表达产物的SDS—PAGE和薄层凝胶扫描分析。结果：经IPTG诱导后表达菌DE3的裂解产物与对照菌相比出现了一条新的表达条带，其大小与经DNA。?001。S分析的外源核苷酸融合蛋白的理论推导值53．9kDa相符。嗜水气单胞菌Aer‘毒素能在大肠杆菌中高效表达，经1mmol／L IPTG诱导1、2、3、4h的表达量分别占菌体蛋白总量的31．74％、42．41％和47．83％、48．57％。重组Aer。毒素的纯化及天然Aer毒素和重组Aer毒素的抗原性分析将原核表达系统表达的重组Aer毒素经SDS—PAGE后，切下目的蛋白，利用电洗脱法将蛋白洗脱出来，后经透析、PEG8000浓缩、定量，对獭兔免疫。首次免疫用弗氏完全佐剂乳化，弗氏不完全佐剂乳化三次加强免疫，免疫的抗原量每只兔子每次100gg。免疫结束10天后，獭兔心脏采血，分离血清后。免疫后的血清，提取血清IgG。以饱和硫酸铵法提取具B一溶血圈的嗜水气单胞菌株,4ffCS02的天然Aer毒素。甲醛脱毒后以同样免疫程序免疫獭兔制备免疫血清并分离IgG，然后做Wes‘tern blotting检测。Western blotting结果，利用纯化的重组Aer毒素制备的兔抗血清可以很好地识别嗜水气单胞菌株．／fftCS02产生的天然Aer’毒素，抗天然Am’毒索的抗体也能识别初步纯化的重组Aer毒素。，体外表达的重组Aer-毒素保留了天然Aer。毒素的抗原性，重组Aer毒素和天然Aex。毒素具有的抗原性。关键词：嗜水气单胞菌论文Aer毒素论文原核表达论文抗原性分析论文
中文摘要7-9
文献综述9-14
研究内容14-48
实验一 嗜水气单胞菌Aer毒素基因的克隆及核苷酸序列分析14-28
1 与方法14-20
2 结果20-22
3 讨论22-23
4 小结23-28
实验二 嗜水气单胞菌Aer毒素在大肠杆菌中的表达28-37
1 与方法28-32
2 结果32-35
3 讨论35
4 小结35-37
实验三 嗜水气单胞菌重组Aer毒素的纯化及重组和天然Aer毒素的抗原性分析37-48
1 与方法37-42
2 结果42-46
3 讨论46-47
4 小结47-48
48-49