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摘要：原发性和继发性耐药依然是肿瘤临床治疗面对的瓶颈不足。肿瘤细胞的耐药形成机制不仅与高表达耐药基因有关，肿瘤细胞高表达Bcl-2等抗凋亡蛋白导致凋亡逃逸是肿瘤细胞耐药的另一个重要机制。由此，Bcl-2特异性抑制剂的发现为逆转肿瘤耐药提供了新的可能。目前有实验结果提示自噬、内质网应激等信号途径参与了肿瘤细胞的耐药形成机制。探讨表明Bcl-2不仅仅参与线粒体途径凋亡的调控，定位于内质网的Bcl-2还参与调控内质网应激途径介导的细胞凋亡，同时与具有BH3区域的Becpn1结合以而抑制Becpn-1依赖的细胞自噬，BH3-only蛋白能通过抑制Bcl-2或Bcl-XL，释放Becpn-1，诱导细胞自噬的发生。尽管内质网应激和自噬是细胞中两种不同的独立的应答机制，但它们之间有着着重要的联系。有人认为活化的自噬帮助细胞抵抗化疗药物诱发的内质网应激，表明自噬可能参与了细胞耐药历程。Bcl-2参与了自噬、内质网应激等信号途径的调控，被认为是多条信号通路的交叉点。由此可见，如何利用Bcl-2抑制剂通过干扰内质网应激-自噬之间的平衡，以而诱导肿瘤细胞凋亡，可能为肿瘤耐药的治疗提供新的线索。S1是大连理工大学精细化工国家重点实验室设计、合成的小分子BH3-only蛋白的模拟物，能特异性的与Bcl-2和Mcl-1抗凋亡蛋白结合，通过干扰Bcl-2/Bax、Mcl-1/Bak相互作用，以而诱导肿瘤细胞发生凋亡。体内外实验已经证明S1可诱导肝癌、乳腺癌等肿瘤细胞发生线粒体途径凋亡，发挥抗肿瘤作用。本实验利用卵巢癌细胞株SKOV3和耐药细胞株SKOV3/DDP为探讨对象，检测了内质网-自噬途径在S1诱导SKOV3和SKOV3/DDP细胞死亡历程中的作用及其机制，为Bcl-2抑制剂杀伤卵巢癌耐药细胞的作用机制探讨提供新的线索。策略⑴MTT法检测S1对SKOV3和SKOV3/DDP细胞存活率；倒置显微镜观察S1作用24h对卵巢癌细胞形态的影响；Hoechst33342染色观察细胞核凋亡；TUNEL染色及流式细胞术检测细胞凋亡水平。⑵通过JC-1染色及流式细胞术检测线粒体膜电势的变化；Western blot策略检测线粒体凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、胞浆Cyto c、Caspase-3的变化。⑶共聚焦显微镜观察细胞PDI蛋白表达变化；Western Blot技术检测PDI、Grp78蛋白表达变化以及内质网相关蛋白PERK、p-PERK、JNK、p-JNK、Caspase-4和Cleed caspase-4蛋白表达变化。内质网应激抑制剂TUDCA（tauroursodeoxychopc acid）对S1诱导的内质网应激的影响。⑷共聚焦显微镜观察细胞LC3点状聚集；Western Blot技术检测LC3、Atg12-Atg5、p62和泛素化蛋白表达变化；间接免疫荧光法检测LC3和p62蛋白共定位，p62和Ub蛋白共定位，以及Becpn-1和Bcl-2蛋白共定位；免疫共沉淀技术检测Becpn-1蛋白与Bcl-2蛋白的结合水平。自噬抑制剂3-腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）对S1诱导耐药细胞自噬的影响。⑸观察3-MA抑制细胞自噬，SKOV3/DDP细胞内质网应激的变化。MTT法检测细胞存活率的变化；间接免疫荧光法检测PDI荧光表达变化；Western Blot技术检测内质网相关蛋白表达变化。结果⑴不同剂量S1作用12h、24h不仅能够显著抑制人卵巢癌SKOV3细胞而且对其顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP细胞的生长亦具有显著的抑制作用，并诱导细胞凋亡的发生。⑵S1通过抑制Bcl-2蛋白表达、推动Bax活化，诱导SKOV3和SKOV3/DDP细胞线粒体膜电势下降、细胞色素c释放以及Caspase-3活化，S1通过线粒体凋亡途径诱导人卵巢癌细胞死亡。⑶S1能够诱导SKOV3和SKOV3/DDP细胞内质网应激标志蛋白表达上调，进而推动内质网特有的Caspase-4活化，诱导卵巢癌细胞发生内质网应激介导的细胞凋亡，尽管耐药细胞株SKOV3/DDP内质网应激活化的时间（以8h开始）晚于SKOV3细胞（以4h开始），但当S1作用到12h时，两种细胞发生内质网应激程度以及内质网应激介导的细胞凋亡程度没有显著差别。抑制内质网应激能够显著减少S1诱导内质网应激介导的细胞凋亡。⑷进一步检测内质网应激主要信号通路蛋白表达发现，在SKOV3细胞中S1能诱导内质网应激PERK通路的活化，但在SKOV3/DDP细胞S1不仅能诱导内质网应激PERK通路的活化，也能诱导IRE1-JNK通路JNK的磷酸化，抑制JNK能够显著减少S1诱导的耐药细胞死亡。⑸S1作用短时间（2h、4h）能显著推动SKOV3/DDP细胞LC3点状聚集以及自噬相关蛋白表达增加，但是SKOV3细胞中自噬相关蛋白表达未有显著变化。进一步探讨发现S1通过干扰Bcl-2蛋白与Becpn-1蛋白结合，释放游离Becpn-1增加，激活自噬。在耐药细胞SKOV3/DDP中，S1作用能诱导泛素化蛋白和p62蛋白表达增加以及二者的共表达，活化的自噬通过p62途径降解泛素化的错误折叠蛋白。⑹自噬抑制剂能够降低S1诱导的耐药细胞LC3点状聚集以及自噬相关蛋白表达。MTT结果显示早期抑制自噬，细胞存活率显著降低。⑺在耐药细胞SKOV3/DDP中，用3-MA阻断自噬可以显著推动S1诱导的内质网应激活化，Caspase-4蛋白表达和JNK磷酸化显著增加。S1作用时间延长（12h）自噬活化减弱，抑制自噬对于耐药细胞存活率未有显著的影响。结论Bcl-2抑制剂S1不仅能够有效抑制人卵巢癌细胞株SKOV3细胞，而且对其顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP细胞也具有显著的抑制作用。一方面通过线粒体凋亡途径诱导细胞死亡；另一方面通过诱导内质网应激途径的Caspase-4活化推动内质网应激介导的细胞凋亡。尽管S1作用早期通过干扰Bcl-2和Becpn-1蛋白相互结合诱导耐药细胞株自噬活化，减弱内质网应激水平，但是随着S1作用时间延长，自噬活化减弱，内质网应激PERK通路和JNK信号通路活化增强，内质网应激介导的凋亡起主导作用以而有效抑制卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP细胞。本探讨首次探讨了自噬和内质网应激在Bcl-2特异性抑制剂S1诱导人卵巢癌耐药细胞死亡历程中的相互作用，为临床运用Bcl-2抑制剂治疗卵巢癌耐药提供了论述依据。关键词：BH3模拟物论文耐药论文内质网应激论文自噬论文人卵巢癌论文
中文摘要4-8
Abstract8-16
第1章 文献综述16-32
1.1 BCL-2 蛋白家族16-22
1.1.1 Bcl-2 蛋白家族在凋亡中的作用16-18
1.1.2 Bcl-2 蛋白与肿瘤耐药18-19
1.1.3 以 Bcl-2 蛋白为靶点的抑制剂19-21
1.1.4 小分子化合物 S121-22
1.2 内质网应激22-27
1.2.1 概述22-23
1.2.2 内质网应激反应的主要信号通路23-24
1.2.3 内质网应激介导的细胞凋亡24-25
1.2.4 Bcl-2 蛋白与内质网应激25-27
1.3 自噬27-32
1.3.1 概述27-28
1.3.2 Bcl-2 蛋白参与调节自噬28
1.3.3 Bcl-2 蛋白家族调控内质网应激和自噬28-32
第2章 实验部分32-82
2.1 S1 通过线粒体途径诱导人卵巢癌细胞凋亡32-46
2.1.1 前言32-34
2.1.2 材料和策略34-39
2.1.3 实验结果39-44
2.1.4 讨论44-46
2.1.5 小结46
2.2 内质网应激在 S1 诱导人卵巢癌细胞凋亡中的作用46-62
2.2.1 前言46-47
2.2.2 材料和策略47-48
2.2.3 实验结果48-61
2.2.4 讨论61-62
2.2.5 小结62
2.3 自噬在 S1 诱导人卵巢癌耐药细胞内质网应激介导的凋亡中的作用62-82
2.3.1 前言62-65
2.3.2 材料和策略65
2.3.3 实验结果65-77
2.3.4 讨论77-79
2.3.5 小结79-82
第3章 结论82-84