摘要：目的探讨雷公藤内酯醇(triptopde，TP/TL)联合紫杉醇对人卵巢癌耐顺铂细胞株（COC1/DDP）的体外活性的影响及其机制。策略1、MTT法检测紫杉醇对COC1/DDP细胞增殖的影响：设空白对照组、0.39μg/ml、0.78μg/ml、1.56μg/ml、3.13μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml的紫杉醇组[1]、调零组。利用四偶氮唑盐(MTT)比色法检测各孔细胞的光吸收值（OD值），通过OD值可浅析，不同浓度的紫杉醇作用于COC1/DDP细胞24小时后对COC1/DDP细胞增殖的影响，并计算各组的细胞生长抑制率。2、MTT法检测雷公藤内酯醇联合紫杉醇作用COC1/DDP细胞24、48、72小时后对细胞增殖的影响：设空白对照组、紫杉醇组（3.13ug/ml）、低浓度雷公藤内酯醇组（3ng/ml）、中浓度雷公藤内酯醇组（10ng/ml）、高浓度雷公藤内酯醇组（50ng/ml）[2]、紫杉醇+低浓度雷公藤内酯醇、紫杉醇+中浓度雷公藤内酯醇、紫杉醇+高浓度雷公藤内酯醇、调零组。利用MTT比色法检测各孔细胞的OD值，计算出各组药物对COC1/DDP细胞作用24、48、72小时后的细胞生长抑制率，利用金氏公式计算两药的合用指数（q）浅析两药联合运用的效果：q=E(AB)/[EA+(1-EA)×EB]，其中E(AB)为两药合用的抑制率，EA和EB为各药单用时的抑制率，q=0.85～1.15表示两药作用相加；q1.15表示两药作用协同；q0.85表示两药作用拮抗[3]。3、透射电子显微镜观察雷公藤内酯醇联合紫杉醇作用于COC1/DDP细胞24小时后的超微结构变化：设空白对照组、雷公藤内酯醇组（10ng/ml）、紫杉醇组（3.13μg/ml）、雷公藤内酯醇联合紫杉醇组，各组分别作用于COC1/DDP细胞24小时后，通过透射电子显微镜观察细胞超微结构的转变。4、流式细胞仪检测雷公藤内酯醇联合紫杉醇作用于COC1/DDP细胞24小时后各细胞周期的细胞所占比例及细胞凋亡情况：设空白对照组、雷公藤内酯醇组（10ng/ml）、紫杉醇组（3.13μg/ml）、雷公藤内酯醇联合紫杉醇组，各组分别作用于COC1/DDP细胞24小时后，用流式细胞仪检测各组各细胞周期的细胞所占比例及细胞凋亡情况。5、免疫组化检测雷公藤内酯醇联合紫杉醇作用于COC1/DDP细胞24小时后细胞Caspase-7蛋白的表达情况：设空白对照组、雷公藤内酯醇组（10ng/ml）、紫杉醇组（3.13μg/ml）、雷公藤内酯醇联合紫杉醇组，分别作用COC1/DDP细胞24小时后，离心固定，并按常规策略制备石蜡块，用免疫组化Epvision TMplus法检测各组细胞Caspase-7蛋白表达情况。结果1、紫杉醇对COC1/DDP细胞增殖的影响：不同浓度的紫杉醇对COC1/DDP细胞有显著的增殖抑制作用，且抑制作用随着紫杉醇浓度的增加而增强，有着显著的剂量依赖性（P0.05）。2、雷公藤内酯醇联合紫杉醇对COC1/DDP细胞增殖的影响：雷公藤内酯醇联合紫杉醇对COC1/DDP细胞的抑制作用强于其各自单用对COC1/DDP细胞的抑制作用（P0.05），随着雷公藤内酯醇浓度的增加其抑制作用增强（P0.05），有着剂量-时间依赖性（P0.05）。各联合用药组作用于COC1/DDP细胞24小时后，合用指数分别为1.16、1.23、1.17；48小时后合用指数分别为0.96、1.02、1.11；72小时后合用指数分别为0.93、0.95、1.11。根据金氏公式可以推测，两药合用24小时后的作用效果体现为协同作用；两药合用48、72小时后的作用效果体现为相加作用。3、雷公藤内酯醇联合紫杉醇对COC1/DDP细胞超微结构的影响透射电子显微镜下可见空白对照组COC1/DDP细胞形态正常，细胞核为卵圆形，染色质丰富；雷公藤内酯醇组、紫杉醇组、雷公藤内酯醇联合紫杉醇组均可见到COC1/DDP细胞细胞膜表面微绒毛消失，线粒体增加、内质网扩张，细胞膜皱缩，细胞核固缩、碎裂、溶解等凋亡样转变。4、雷公藤内酯醇联合紫杉醇对COC1/DDP细胞的细胞周期和细胞凋亡率的影响雷公藤内酯醇组、紫杉醇组、雷公藤内酯醇联合紫杉醇组的凋亡率均高于空白对照组（P0.05）；雷公藤内酯醇联合紫杉醇组对COC1/DDP细胞的凋亡率高于其各自单用组（P0.05）；雷公藤内酯醇组的凋亡率高于紫杉醇组（P0.05）。雷公藤内酯醇组细胞周期中G1期的比例高于其余各组（P0.05），紫杉醇组、雷公藤内酯醇联合紫杉醇组的COC1/DDP细胞周期中G2/M期的比例较雷公藤内酯醇组及空白对照组显著增高（P0.05），其中紫杉醇组细胞周期中G2/M期的比例最高（P0.05）。由此可以推测，雷公藤内酯醇诱导细胞凋亡可能与将细胞周期阻滞于G1期有关，而紫杉醇及雷公藤内酯醇联合紫杉醇诱导细胞凋亡可能与将细胞周期阻滞于G2/M期有关。5、雷公藤内酯醇联合紫杉醇作用COC1/DDP细胞后细胞Caspase-7的表达情况雷公藤内酯醇联合紫杉醇作用于COC1/DDP细胞24小时后，免疫组化检测COC1/DDP细胞Caspase-7的表达情况发现，空白对照组COC1/DDP细胞可见部分胞浆呈淡，而雷公藤内酯醇组、紫杉醇组及雷公藤内酯醇联合紫杉醇组可见COC1/DDP细胞中绝大部分胞浆呈棕、棕褐色。各用药组的细胞Caspase-7蛋白阳性比例均高于空白对照组（P0.05），雷公藤内酯醇组细胞Caspase-7蛋白阳性比例高于紫杉醇组（P0.05），雷公藤内酯醇联合紫杉醇组的细胞Caspase-7蛋白阳性比例高于其各自用药组（P0.05）。结论1、不同浓度的紫杉醇对COC1/DDP细胞有显著的增殖抑制作用，且抑制作用随着紫杉醇浓度的增加而增强，有着显著的剂量依赖性。2、雷公藤内酯醇联合紫杉醇对COC1/DDP细胞的抑制作用高于其各自单用组，且有着剂量-时间依赖性；两药联合运用的效果体现为协同/相加作用。3、雷公藤内酯醇联合紫杉醇能推动COC1/DDP细胞凋亡，使其细胞呈细胞核固缩、碎裂、溶解等凋亡样转变，其诱导COC1/DDP细胞凋亡的可能机制与阻滞细胞周期于G2/M期，影响细胞DNA合成和有丝分裂有关。4、雷公藤内酯醇联合紫杉醇作用COC1/DDP细胞后的其细胞Caspase-7蛋白的表达高于其各自单用药组，由此推测，雷公藤内酯醇联合紫杉醇推动COC1/DDP细胞凋亡机制也可能与其促使细胞Caspase-7蛋白表达上调有关。关键词：雷公藤内酯醇论文紫杉醇论文COC1/DDP论文凋亡论文流式细胞术论文Caspase-7论文
摘要3-6
ABSTRACT6-12
英文缩略词12-14
第1章 引言14-16
第2章 材料与策略16-25
2.1 材料16-18
2.1.1 药物来源16
2.1.2 细胞株16
2.1.3 主要试剂16
2.1.4 主要仪器及材料16-17
2.1.5 主要实验溶液配制策略17-18
2.2 探讨策略及内容18-24
2.2.1 细胞培养18
2.2.2 细胞传代18-19
2.2.3 细胞冻存19
2.2.4 MTT 法检测紫杉醇对 COC1/DDP 细胞增殖的影响19-20
2.2.5 MTT 法检测雷公藤内酯醇联合紫杉醇对 COC1/DDP 细胞增殖的影响20-21
2.2.6 透射电子显微镜观察各组药物对 COC1/DDP 细胞超微结构的变化21
2.2.7 流式细胞术检测雷公藤内酯醇联合紫杉醇对 COC1/DDP 细胞周期和细胞凋亡的影响21-22
2.2.8 免疫组化浅析雷公藤内酯醇联合紫杉醇作用于 COC1/DDP小时后细胞 Caspase-7 蛋白的表达情况22-24
2.3 统计浅析24-25
第3章 结果25-34
3.1 COC1/DDP 细胞生长情况25
3.2 不同浓度的紫杉醇对 COC1/DDP 细胞增殖的影响25-27
3.3 雷公藤内酯醇联合紫杉醇对 COC1/DDP 细胞增殖的影响27-28
3.4 雷公藤内酯醇联合紫杉醇对 COC1/DDP 细胞超微结构的影响28-30
3.5 雷公藤内酯醇联合紫杉醇对 COC1/DDP 细胞的细胞周期和细胞凋亡的影响30-32
3.6 雷公藤内酯醇联合紫杉醇作用 COC1/DDP 细胞后细胞 Caspase-7 的表达情况32-34
第4章 讨论34-43
4.1 卵巢癌治疗近况及其耐药机制35-36
4.2 COC1/DDP 细胞的生物学特性36
4.3 紫杉醇对 COC1/DDP 细胞的体外抑制作用36-37
4.4 雷公藤内酯醇联合紫杉醇对 COC1/DDP 细胞的协同抑制作用37-38
4.5 雷公藤内酯醇联合紫杉醇对 COC1/DDP 细胞体外抑制作用的可能机制38-42
4.5.1 雷公藤内酯醇抗肿瘤的机制38
4.5.2 紫杉醇抗肿瘤的机制38-39
4.5.3 雷公藤内酯醇联合紫杉醇对 COC1/DDP 细胞超微结构的影响39
4.5.4 雷公藤内酯醇联合紫杉醇对 COC1/DDP 细胞周期和细胞凋亡的影响39-40
4.5.5 雷公藤内酯醇作用于 COC1/DDP 细胞 Caspase-7 蛋白的表达情况40-42
4.6 结语与展望42-43
第5章 结论43-44
致谢44-45
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