摘要：中华锯齿米虾(Neocaridina denticulata sinensis)属于甲壳纲(Crustacea),十足目(Decapoda),匙指虾科(Atyidae),新米虾属(Neocaridina)。中华锯齿米虾是一种小型虾类,营淡水生活。中华锯齿米虾具有广盐、广温性、繁殖力快、生命力强等特点,是一种可以运用在生态、生理和毒理等实验中的良好材料。并且由于中华锯齿米虾产量大,还有一定的经济价值。卵黄蛋白原(Vg)是广泛地有着于卵生脊椎和无脊椎动物体内的雌性特异性蛋白,是卵黄蛋白的前体。虾类在未开口时期,其胚胎仔体发育、生长所需要的能量和营养完全依赖卵黄,而卵黄的主要成分是卵黄蛋白,由此卵黄蛋白的数量和质量对于维持虾类早期的生命至关重要。之前人们利用组织学、免疫组化、电子显微镜观察等策略对甲壳动物的Vg进行了探讨。近些年,人们通过对虾类Vg cDNA的探讨进一步对Vg的表达特点有了更进一步的了解,但是关于中华锯齿米虾Vg cDNA的探讨未见报道。本论文利用NCBI的blastn系统查询了明对虾,罗氏沼虾等Vg cDNA序列,利用Bioedite进行比对后找到其序列保守区域,根据保守区域设计引物,以成熟雌性中华锯齿米虾卵巢为材料提取RNA,反转录为cDNA,以cDNA为模版进行PCR,1%琼脂糖凝胶电泳检测,切胶回收目的片段,连接pMD-19T载体,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆送去测序,得到了一条长1453 bp的cDNA序列。将此序列进行与罗氏沼虾,高背长额虾Vg cDNA序列进行比对,结果显示其与罗氏沼虾、高背长额虾Vg mRNA序列的同一性为54.8%和51.5%。将所得序列与11种甲壳动物Vg cDNA序列进行比对建立了系统发生树,结果表明中华锯齿米虾与罗氏沼虾、高背长额虾的亲缘联系较近,与三疣梭子蟹亲缘联系最远,系统发生树结果表明Vg保守性与虾类的进化有很强的相关性。本实验利用中华锯齿米虾Vg cDNA的部分片段设计了表达引物,构建了表达重组质粒pET-VgE,利用表达菌株Rosetta成功进行了蛋白表达,通过Western blot技术对此蛋白进行浅析,以蛋白水平对之前得到Vg cDNA序列的正确性进行了进一步的确认,结果确认得到的序列为中华锯齿米虾Vg cDNA序列。由于利用此策略进行蛋白表达及之后的蛋白纯化均比较容易,所以此蛋白为今后建立更成熟的、简便的中华锯齿米虾卵黄蛋白发生与进展的鉴定系统奠定了基础。本实验还根据得到的Vg cDNA的部分片段设计了DNA探针,根据中华锯齿米虾卵巢的不同发育期,分别提取卵巢和肝胰腺的总RNA,用RT-PCR策略进行半定量实验,探讨不同卵巢发育时期卵巢与肝胰腺在Vg表达中所发挥的作用。结果表明,中华锯齿米虾内源性卵黄物质发生的主要场所是卵巢,外源性Vg发生场所为肝胰腺。在卵巢发育前期与中期肝胰腺为主要合成部位,后期卵巢为主要合成部位。推测中华锯齿米虾卵黄的生成包括两个阶段,第一阶段是肝胰腺内合成Vg;第二个阶段是肝胰腺合成的Vg被卵母细胞吸收后在卵巢中进行进一步修饰,以生成成熟的卵黄蛋白供胚胎发育所用。关于中华锯齿米虾的Vg在肝胰腺的具体发生方式还有待于进一步的探讨。关键词：中华锯齿米虾论文卵黄蛋白原论文同源克隆论文蛋白表达论文表达特点论文
摘要5-7
Abstract7-11
第1章 绪论11-20
1.1 探讨近况11-19
1.1.1 近年来卵黄蛋白原的探讨进展11-13
1.1.2 近年甲壳动物卵黄蛋白原基因克隆的探讨进展13-14
1.1.3 近年来卵黄蛋白原的探讨在系统进化中的运用14-15
1.1.4 近年卵黄蛋白原合成位点的探讨进展15-18
1.1.5 卵黄蛋白原作为“生物标记物”的探讨进展18-19
1.2 探讨目的及作用19-20
第2章 中华锯齿米虾卵黄蛋白原CDNA 序列的克隆20-38
2.1 实验材料与策略20-27
2.1.1 材料20
2.1.2 试剂与仪器20-22
2.1.3 策略22-27
2.1.3.1 引物的设计22-23
2.1.3.2 卵黄蛋白原cDNA 序列中间片段的克隆23-26
2.1.3.3 卵黄蛋白原cDNA 序列3’-RACE26
2.1.3.4 序列浅析及其系统发生树的建立26-27
2.2 结果27-36
2.2.1 卵巢总RNA 的提取27
2.2.2 卵黄蛋白原基因中间片段的克隆及3’RACE27-36
2.3 讨论36-38
第3章 中华锯齿米虾卵黄蛋白原部分肽段的原核表达38-48
3.1 材料与策略38-42
3.1.1 材料38
3.1.2 试剂与仪器38-40
3.1.3 策略40-42
3.1.3.1 卵黄蛋白原基因表达重组子的制备40-41
3.1.3.2 卵黄蛋白原基因的表达条件的优化41
3.1.3.3 pET-VgE 表达产物的可溶性浅析41-42
3.1.3.4 Western blot 鉴定表达蛋白42
3.2 结果42-46
3.2.1 卵黄蛋白原基因表达重组质粒的构建42-44
3.2.2 卵黄蛋白原部分cDNA 片段的表达44-45
3.2.3 pET-VgE 表达产物的可溶性浅析45-46
3.2.4 Western blot 鉴定表达蛋白46
3.3 讨论46-48
第4章 中华锯齿米虾卵黄蛋白原基因表达特点的探讨48-53
4.1 材料与策略48-49
4.1.1 材料48
4.1.2 试剂与仪器48
4.1.3 策略48-49
4.1.3.1 引物设计48
4.1.3.2 中华锯齿米虾成熟雌虾各组织总RNA 的提取48
4.1.3.3 RT-PCR48-49
4.1.3.4 结果浅析49
4.2 结果49-50
4.3 讨论50-53
结论53-54
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