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摘要：前言下咽鳞状细胞癌是耳鼻咽喉头颈外科最常见的恶性肿瘤之一,具有发生位置隐蔽、浸润性极强、易粘膜下扩散、原发病变呈多中心生长的特点。因早期无显著的症状、缺乏特异性体征和可靠的诊断措施,所以,多数患者在临床确诊并接受治疗时,已属于晚期,病变常累及喉腔、颈段食道和舌根等器官；同时,由于喉咽部淋巴管丰富,极易发生颈淋巴结转移和包膜外扩散,并侵犯周围组织器官,如颈动脉等重要的血管,所以,下咽鳞癌是头颈部预后最差的恶性肿瘤之一。由于下咽癌生长部位的特殊性,手术治疗后,可能导致语言、呼吸及吞咽器官的功能障碍,严重影响患者的存活质量；而放疗和化疗又有着治疗不彻底、并发症多、患者痛苦较大等不足。由此,尽快在分子生物学的基础上提出新的诊断策略和简便有效、毒副作用小的治疗手段就成为亟须解决的课题。生物膜是细胞生命活动的主要结构基础,与细胞的恶性转化及肿瘤的演进密切相关。上个世纪50年代,Yamada用电子显微镜发现并命名了细胞质膜微囊—Ceolae;1972年,Singer和Nicolson提出“液相双层脂质镶嵌模型”；20世纪90年代探讨发现：细胞膜的双层脂质结构是不均一的,结构蛋白Ceopn与某些富含胆固醇和鞘脂的微区域的结构变化密切相关,这些区域被称为脂筏,无结构蛋白时呈平板状,脂筏与Ceopn结合后形成的烧瓶状膜结构即Ceolae。Ceopn-1(C1)是Ceolae的标志性蛋白,为分子量约22kd的膜内蛋白质,其基因位于7q31.1,是形成烧瓶状结构Ceolae的必需成分。目前,C1与肿瘤形成之间的联系已成为探讨的热点。探讨证实：在大多数肿瘤细胞中,如乳腺癌、肺癌、宫颈癌、卵巢癌、肉瘤,C1表达下降,为抑癌基因；但在某些肿瘤,如甲状腺滤泡状癌中没有C1的表达；而在前列腺癌、胰腺导管腺癌及食道鳞状细胞癌中其表达水平上调,提示：在这些癌的形成历程中,C1是作为肿瘤推动因子。由此,C1在肿瘤中的作用可能与组织相关。在本课题中,我们成功构建了C1-小干扰RNA-慢病毒载体,通过感染下咽癌FaDu细胞株,进而检测C1对该细胞株体外生长的作用；并成功构建下咽鳞状细胞癌FaDu细胞株移植瘤动物模型,通过定期瘤体注射C1-小干扰RNA-慢病毒载体,以及后期对肿瘤组织的检测来探讨Cl对FaDu细胞株体内生长的作用。目的构建人C1-小干扰RNA-慢病毒载体(C1-RNAi-lentivirus)并转染下咽鳞状细胞癌FaDu细胞株,筛选获得稳定干扰C1表达的FaDu细胞。进而探讨C1-RNAi-lentivirus对人下咽鳞状细胞癌FaDu细胞株体内和体外生长的影响。策略1.构建人C1-RNA干扰慢病毒载体。设计针对Cl的shRNA序列,Age Ⅰ和EcoRⅠ进行载体质粒双酶切,运用基因重组技术插入pGCSL-GFP慢病毒表达载体中,RT-PCR和DNA测序鉴定重组克隆。重组病毒质粒及其3种辅助包装原件载体质粒通过Lipofectamine TM2000共转染293T细胞,培养48h后,收集细胞培养上清液,将其浓缩后在293T细胞中测定病毒滴度,并进行大量包装和备用细胞转染。2. C1-RNAi-lentivirus对FaDu细胞体外生长的作用。运用C1-RNAi-lentivirus转染FaDu细胞,实验设立pGCSL-GFP-空载体对照组(GFP-lentivirus)和空白对照组。确定G418的最佳筛选浓度,于转染24h后,加入最佳筛选浓度的G418筛选稳定干扰C1表达的细胞。待细胞生长成肉眼可见的克隆后,利用浸有胰酶的无菌滤纸片消化挑取克隆,扩增培养。荧光倒置显微镜下观察并计算C1-RNAi-lentivirus的转染效率。采取RT-PCR、Western-blot策略检测细胞中C1的mRNA和蛋白水平的敲除效率。运用原位末端标记法(TdT-mediated dUTPnick end labepng, TUNEL)检测转染C1-RNAi-lentivirus后FaDu细胞的体外凋亡情况。3. C1-RNAi-lentivirus对FaDu细胞体内生长的作用。构建BALB/c-nude裸鼠下咽鳞状细胞癌FaDu细胞株移植瘤模型,待肿瘤长至一定时间和体积时,将所有动物随机分组。实验设立GFP-lentivirus阴性对照组和空白对照组。给药策略采取瘤周多点注射。实验组动物每周定期瘤周注射C1-RNAi-lentivirus(1×107TU,0.1m1),阴性对照组动物注射GFP-lentivirus(1×107TU,0.1ml),空白对照组注射同剂量的PBS,并每隔4d测量各组所有动物的肿瘤最长径与最短径,计算肿瘤体积变化和抑制率。自注射时间起32d后,采取脱臼法处死实验动物并取出移植瘤,测量标本体积并称重。以RT-PCR.免疫组化等策略检测三组肿瘤组织中目的基因C1的mRNA和蛋白表达变化情况,以而对C1-小干扰RNA-慢病毒载体在FaDu细胞株体内生长的作用进行评价,并探讨其可能的作用机制。结果1.RT-PCR和DNA测序鉴定重组克隆结果显示,实验采取基因重组技术成功构建C1-小干扰RNA-慢病毒载体,命名为C1-RNAi-lentivirus,测定滴度为1×108U/ml。2.将Cl-小干扰RNA-慢病毒载体转染下咽癌FaDu细胞,经G418筛选,30天后获得稳定干扰C1表达的细胞,细胞转染效率90%。运用RT-PCR检测策略证实,与空白对照组(1.297±0.068)和阴性对照组(1.183±0.093)相比,RNA干扰组细胞的C1的mRNA表达显著降低(0.47±0.050,P0.05),差别有统计学作用。Western-blot检测结果表明,与空白对照组(0.973±0.117)和阴性对照组(0.83±0.091)相比,C1-RNAi-Lentivirus转染组细胞的C1蛋白表达水平(0.43±0.098,P0.05)显著降低,差别有统计学作用。TUNEL检测结果证实,与空白对照组(AI=5.55±0.47%)和阴性对照组(AI=7.52±1.90%)相比,C1-RNAi-Lentivirus转染组(AI=22.39±2.61%,P0.05)细胞的凋亡指数显著增加,差别有统计学作用。3.成功构建BALB/c-nude裸鼠下咽鳞状细胞癌FaDu细胞株移植瘤模型。定期注射C1-RNAi-Lentivirus组的裸鼠移植瘤平均重量和体积(1.24±0.42g,1.40±0.49cm3),均低于阴性对照组裸鼠移植瘤(1.79±0.42g,1.97±0.45cm3)和空白对照组移植瘤(1.88±0.54g,2.10±0.55cm3,P0.05)。抑瘤率分别为30.8%和34.0%。对各组移植瘤进行的RT-PCR检测结果证实,与空白对照组(1.348±0.031)和阴性对照组(1.175±0.055)相比,C1-RNAi-Lentivirus注射组肿瘤组织的C1mRNA(0.671±0.070,P0.05)表达水平降低,条带亮度显著减弱,差别有统计学作用。免疫组化染色结果显示,虽然治疗组移植瘤Cl蛋白表达下降,但差别没有统计学作用(P0.05)。结论本探讨结果表明,重组C1-RNAi-lentivirus在体外转染下咽鳞状细胞癌FaDu细胞株后,G418筛选30天后可以获得稳定干扰C1表达的细胞,RT-PCR和Western-blot检测策略验证了基因的敲除效率。TUNEL实验结果显示,体外培养历程中,下调C1基因的表达,FaDu细胞的凋亡比对照组显著增加。实验成功构建BALB/c-nude裸鼠下咽鳞状细胞癌FaDu细胞株移植瘤模型,待肿瘤长至一定体积后,运用C1-RNAi-lentivirus定期瘤内多点注射,可以减缓肿瘤组织的生长,即FaDu细胞在体内的生长增殖受到抑制。以上实验结果提示,C1在下咽鳞状细胞癌FaDu细胞株的生长历程中可能起肿瘤推动因子的作用,下调C1的表达可能成为FaDu细胞形成的下咽癌的治疗策略之一。关键词：Ceopn-1论文RNA干扰论文慢病毒论文下咽论文鳞状细胞癌论文
中文摘要6-10
ABSTRACT10-14
符号说明14-16
前言16-18
第一部分 Ceopn-1小干扰RNA慢病毒载体的构建18-29
材料与策略18-23
结果23-24
讨论24-27
结论27-28
附图28-29
第二部分 慢病毒介导的Ceopn-1小干扰RNA对下咽癌FaDu细胞株生长作用的体外实验探讨29-51
材料与策略29-41
结果41-42
讨论42-46
结论46-47
附图与附表47-51
第三部分 慢病毒介导的Ceopn-1小干扰RNA对下咽癌FaDu细胞株生长作用的体内实验探讨51-64
材料与策略51-55
结果55-56
讨论56-59
结论59-60
附图与附表60-64