心肌炎猪脑心肌炎病毒VP1蛋白表达和单克隆抗体研制库

摘要：脑心肌炎(Encephalomyocarditis)是一类重要的急性人畜共患性传染病,以脑炎、心肌炎或心肌周围炎为临床主要特点,其病原即脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus, EMCV)可感染的宿主种类很广,包括猪、啮齿类动物、灵长类动物和某些昆虫,其中猪被认为是最易感的宿主。脑心肌炎病毒的感染可使断奶仔猪发生急性心肌炎和突然死亡,使怀孕母猪发生严重的繁殖障碍。脑心肌炎病毒在分类上属于小核糖核酸病毒科心脏病毒属的成员,是单股正链RNA病毒,基因组全长约7.8kb,有一个大的开放阅读框。病毒粒子无囊膜,由VP1、VP2、VP3和VP4四种结构蛋白组成。这四种结构蛋白上都有抗原表位,其中以VPl的抗原性最强,可刺激机体产生中和抗体。本探讨利用PCR策略扩增VP1基因并在大肠杆菌BL21中成功表达了重组蛋白VP1；以纯化的VP1蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,获得7株抗VP1的单克隆抗体,具体内容包括：1.EMCV VP1基因的原核表达与抗体制备以重组质粒pET32a-VP1为模板,经PCR扩增得到含完整阅读框的VP1基因。获得的目的基因克隆至原核表达载体pET28a中,经酶切鉴定正确后转入E.cop BL21中,加IPTG诱导获得重组蛋白pET28a-VP1,大小为33kDa。Western blot结果显示,该重组蛋白可与抗EMCV的多克隆抗体发生特异性反应。经ProBondTM Purification System纯化的pET28a-VP1蛋白用来免疫BALB/c小鼠,获得了抗VP1蛋白的多克隆抗体。Western blot和IFA结果表明,该多抗可特异性地结合VP1蛋白和EMCV.2.EMCV VP1单克隆抗体的制备取纯化的pET28a-VP1蛋白免疫BALB/c小鼠,经细胞融合技术、间接ELISA策略对阳性克隆的筛选以及多次亚克隆后,获得7株能稳定分泌抗VP1蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1F3、1G8、2C8、3A9、6E11、7A7和7C9, Western blot和IFA表明,这7株单抗能特异性识别VP1蛋白和EMCV。ELISA策略测定,杂交瘤细胞株上清效价分别为：1：12800,1：102400,1：51200,1：51200,1：102400,1：102400和1：102400；腹水效价分别为：3.072×106,1.536×106,3.072×106,6.144×106,6.144×106,6.144×106,3.072×106。经小鼠单克隆抗体Ig类／亚类鉴定试剂盒鉴定其亚类,结果显示7株单抗均为IgGl。本探讨用原核表达系统成功表达了重组蛋白重组蛋白pET28a-VP1,并以纯化的重组蛋白VP1免疫BALB/c小鼠成功获得了7株单克隆抗体,为EMCV结构与功能的探讨以及关于EMCV感染的血清学诊断策略的建立奠定了基础。关键词：脑心肌炎病毒论文VP1蛋白论文原核表达论文单克隆抗体论文

摘要7-9

ABSTRACT9-11

第一章 猪脑心肌炎病毒探讨进展11-29

1 病原学11-13

1.1 病毒基因组结构11-12

1.2 病毒基因组所编码蛋白12-13

2 流行病学13-14

3 致病机理14-17

3.1 病毒致病的分子基础14-15

3.2 组织器官的损伤与免疫应答15-17

3.2.1 组织器官的损伤15-16

3.2.2 免疫应答16-17

4 诊断技术17-19

4.1 临床症状与病理变化17

4.2 实验室诊断策略17-19

4.2.1 病毒抗原检测技术17-19

5 疾病防制19-20

6 公共卫生学20-22

的酶切30

2.1.5 目的基因与表达载体的连接30-31

2.1.6 重组质粒的转化31

2.1.7 质粒DNA的小量提取31

2.1.8 重组质粒的鉴定31

2.1.9 序列测定31

2.2 重组蛋白在大肠杆菌中的表达以及蛋白的纯化31-32

2.2.1 重组菌的诱导表达及表达条件的优化31-32

2.2.2 重组蛋白的Western blot鉴定32

2.2.3 重组蛋白的大量表达及纯化32

2.3 重组蛋白VP1抗血清的制备与鉴定32

3 结果32-37

3.1 EMCV VP1基因的扩增32-33

3.2 重组质粒pET28a-VP1的酶切鉴定33-34

3.3 重组菌的诱导表达与SDS-PAGE电泳浅析34

3.4 重组蛋白VP1的Western blot鉴定34-36

3.5 重组蛋白VP1的纯化36

3.6 重组蛋白VP1抗血清的制备与鉴定36-37

4 讨论37-39