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摘要：目的： Gres病（Gres disease，GD）是一种由于自身免疫导致的器官特异性自身免疫性甲状腺疾病（autoimmune thyroid disease，AITD），临床体现为不同程度的弥漫性甲状腺肿、甲状腺毒症、浸润性突眼、胫前粘液性水肿，自身抗体产生、甲状腺组织淋巴细胞浸润是其重要病理特点。但详细的免疫学发病机制尚不清楚。Th17细胞是一种能产生白细胞介素-17（interleukin-17，IL-17）的新型CD4~+T淋巴细胞。IL-17的主要功能是作为一种前炎症细胞因子通过诱导靶细胞产生趋化因子、集落刺激因子（colony stimulating factor，C）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、IL-6等细胞因子，吸引中性粒白细胞和单核细胞到达炎症部位，推动或扩大炎症反应。已有探讨表明，Th17细胞在类风湿性关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的发生中发挥重要作用。GD是典型的自身免疫性甲状腺疾病，其发病机制尚不清楚，本探讨拟通过运用流式细胞术浅析外周血单个核细胞（PBMC）中CD4~+IL-17~+T（Th17）细胞的数量；运用酶联免疫吸附试验（enzyme-pnked immunosorbent assay，ELISA）检测PBMC培养上清中IL-17的水平；运用实时定量（qRT-PCR）检测PBMC中ROR-γt、IFN-γ、IL-4mRNA的表达量；运用免疫组织化学染色策略检测甲状腺组织中IL-17~+细胞的分布及数量变化，旨在探讨Th17细胞在GD发生中的作用。策略：1探讨对象及材料收集30例初发未经过任何治疗的GD患者，诊断标准参照《中国甲状腺疾病诊治指南》（中华医学会内分泌学会，2008年）。将30例年龄、性别相匹配的健康体检者作为正常对照组。免疫组化标本来自6例Gres病患者手术切除的甲状腺和3例创伤死亡的正常甲状腺组织。2策略2.1血清TSH、FT3、FT4水平的检测用商用电化学发光法检测初发GD患者和正常对照组的血清中促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）、游离甲状腺素（freethyroxine，FT4）、游离三碘甲状腺原氨酸（free triiodothyronine，FT3）的水平。2.2PBMC中Th17细胞数量检测采取密度梯度离心法分离新鲜PBMC，经抗人CD3mAb、抗人CD28mAb刺激培养24小时后，取PBMC2×10~5个，运用流式细胞术检测初发GD患者和正常对照组PBMC中CD4~+T细胞和CD4~+IL-17~+T（Th17）细胞的数量。2.BMC培养上清中IL-17水平检测采取密度梯度离心法分离新鲜PBMC，经抗人CD3mAb、抗人CD28mAb刺激培养24小时后，取上清，用人IL-17ELISA试剂盒检测初发GD患者和正常对照组PBMC培养上清中细胞因子IL-17的水平。2.4PBMC中ROR-γt、IFN-γ、IL-4mRNA表达水平提取2.2所述剩余PBMC的mRNA，反转录后，运用qRT-PCR策略检测ROR-γt、IFN-γ、IL-4mRNA的相对表达量，以人GAPDH作为内参照基因。2.5甲状腺组织中IL-17~+细胞的分布和数量运用免疫组织化学染色策略检测甲状腺组织中IL-17~+细胞的分布和数量。2.6统计学浅析：运用SPSS13.0统计软件，计量资料以x±s表示，两组间差别用两样本均数的t检验进行比较。两组间采取双变量相关浅析进行相关性检验，P＜0.05为差别有统计学作用。结果：1血清TSH、FT3、FT4水平收集的30例初发GD组患者均有血清TSH浓度降低，甲状腺激素FT3、FT4升高，符合GD的诊断标准。2PBMC中Th17细胞数量变化经抗人CD3mAb、抗人CD28mAb刺激培养24小时后，与正常对照组比较，初发GD组外周血PBMC中CD4~+IL-17~+T（Th17）细胞占CD4~+T细胞的比例（21.95±3.62%）较正常对照组（9.26±5.85%）显著升高（P0.01）。BMC培养上清中IL-17水平经抗人CD3mAb、抗人CD28mAb刺激培养24小时后，初发GD组PBMC培养上清中IL-17水平（80.56±40.59pg/ml）与正常对照组（15.05±7.82pg/ml）相比显著升高（P0.01）。4PBMC中ROR-γt、IFN-γ、IL-4mRNA的表达水平初发GD组PBMC经抗人CD3mAb、抗人CD28mAb刺激培养24小时后，ROR-γt mRNA表达水平（1.67±0.93）与正常对照组(0.93±0.17）比较显著增高（P0.05）。而IFN-γ、IL-4mRNA的表达水平与正常对照组比较均显著降低（0.31±0.08vs0.69±0.20，2.53±0.70vs7.29±0.83，P0.01）。5甲状腺组织中IL-17~+细胞的分布及数量正常对照组甲状腺组织未见IL-17~+阳性细胞。GD组甲状腺组织滤泡间质内可见散在的IL-17~+阳性细胞。6初发GD组患者PBMC中Th17细胞百分率与血清TSH浓度、血清FT3浓度、血清FT4浓度、ROR-γt、IFN-γ、IL-4mRNA表达量的相关性浅析初发GD组患者，PBMC中CD4~+IL-17~+T（Th17）细胞百分率与血清TSH浓度呈负相关（r=-0.4205，P＜0.05）；与血清FT3浓度呈正相关（r=0.5930，P＜0.01）；与血清FT4浓度呈正相关（r=0.5580，P＜0.01）；与ROR-γt mRNA表达量呈正相关（r=0.5047，P＜0.05）；与IFN-γ mRNA表达量呈负相关（r=-0.5085，P＜0.01）；与IL-4mRNA表达量呈负相关（r=-0.5372，P＜0.01）。结论：1GD患者PBMC中Th17细胞的数量、PBMC培养上清中IL-17水平均显著增高；Th17细胞百分率与血清TSH浓度呈负相关，与血清FT3浓度、血清FT4浓度呈正相关；甲状腺组织滤泡间质有散在IL-17~+细胞。提示Th17细胞在GD的发病中发挥一定作用。2GD患者PBMC接受刺激后ROR-γt mRNA表达量显著增高，IFN-γmRNA、IL-4mRNA表达水平显著降低，提示患者体内CD4~+T细胞活化后分化为Th17细胞增加。关键词：Gres病论文Th17细胞论文IL-17论文ROR-γt论文甲状腺组织论文
摘要4-8
ABSTRACT8-12
前言12-13
材料与策略13-21
结果21-24
附图24-34
附表34-36
讨论36-39
结论39-40