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摘要：[目的]炎症反应在心血管系统疾病如心肌缺血(myocardial ischemia)、动脉粥样硬化(atherosclerosis)等发病历程中起重要作用。信号分子硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)在心血管疾病中发挥重要的作用。本探讨旨在观察外源性H2S对肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbipcal vein endothepal cells, HUVEC)的炎症反应,同时观察外源性H2S对心肌梗死大鼠心肌炎症反应、重构以及血管新生的影响及可能机制,以及内源性H2S调节剂炔丙基半胱氨酸(S-propargyl-cysteine, SPRC),对脂多糖(ppopolysaccharide, LPS)诱导的H9c2心肌细胞的炎症反应以及对TNF-α诱导的HUVEC的炎症反应的影响,并分别探讨SPRC抗炎的可能机制,旨在阐明H2S在心血管炎症反应中的作用并开发出有效的治疗心血管炎症的药物。[策略]1.采取TNF-a诱导HUVEC功能紊乱,以地塞米松(dexamethasone,Dex)和乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, NAC)为阳性对照；采取细胞黏附试验观察NaHS对U937单核细胞与TNF-α激活的HUVEC(?)(?)附的影响；实时逆转录聚合酶联反应(realtime reverse transcription-polymerase chain reaction, realtimeRT-PCR)观察NaHS对TNF-α诱导的黏附分子,如细胞间黏附分子(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)、血管细胞黏附分子(ascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)、P-选择素(P-selectin)和-选择素(E-selectin)的mRNA表达;Western blot法检测NaHHS对TNF-α诱导的ICAM-1、VCAM-1、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)的蛋白表达、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)的磷酸化、ⅠκBα的降解以及核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)p65磷酸化和转位的影响；免疫荧光检测TNF-α诱导的NaHS对NF-KB p65转位和细胞内氧自由基(reactive oxygen species, ROS)的影响；2.冠状动脉前降支永久性结扎制备大鼠心肌梗死模型,给予NaHHS或DL-炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine, PAG)及溶媒对照,分别于心肌梗死后3、14、42天取材。Realtime RT-PCR观察NaHS对ⅠCAM-1、VCAM-1、TNF-α、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)的mRNA表达；采取Western blot法检测NaHS对iNOSs、toll样受体2(toll pke receptor2, TLR2)、内皮依赖性一氧化氮合酶(endothepal nitric oxide synthase, eNOS)、Ⅰ和Ⅲ型胶原(collagen)、HO-1、胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionase-γ-lyasis, CSE)、金属基质蛋白酶(1natrix metalloproteinases, MMPs)、内皮细胞生长因子(vascularendothepal growth factor, VEGF)、MAPK的磷酸化、Akt的激活；免疫组织化学法观察NaHS对iNOS、ICAM-1、VEGF、CD34、I和Ⅲ型胶原表达以及CD68+的炎症细胞浸润；Masson染色观察NaHS对心肌纤维化的的影响；超声心电图观察NaHS(?)(?)心功能的影响；体外培养原代心肌成纤维细胞,采取血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)刺激,Western blot观察NaHS对心肌重构相关蛋白(Ⅰ型胶原、MMPs)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase4, Nox4)表达及信号通路(p38MAPK)激活的影响；免疫荧光观察NaHS对Ang Ⅱ诱导的Ⅰ型胶原表达的影响；3.采取TNF-a诱导HUVEC功能紊乱,同时以Dex和NAC为阳性对照；采取细胞黏附试验观察SPRC(?)寸U937单核细胞与TNF-α激活的HUVEC黏附的影响；Western blot检测SPRC对TNF-α诱导的ICAM-1、VCAM-1、CSE的蛋白表达、MAPK的磷酸化、IκBα的降解以及NF-κB p65磷酸化的影响；免疫荧光检测TNF-α诱导的SPRC对NF-κB p65转位和细胞内ROS的影响;4.采取LPS诱导H9c2心肌细胞炎症反应,采取RT-PCR观察SPRC对LPS诱导的炎症介质,TNF-α、iNOS(?)(?)ICAM-1mRNA表达的影响；酶联免疫吸收法(enzyme-pnked immunosorbent assay, ELISA)检测(?)SPRC对LPS诱导的TNF-a释放的影响;Western blot检测(?)SPRC对Akt磷酸化的影响以及SPRC对LPS诱导的ERK1/2的磷酸化、IkBα的降解以及NF-κBP65磷酸化的影响；免疫荧光检测(?)SPRC对LPS诱导的细胞内ROS的影响；[结果]1NaHS剂量依赖性的抑制TNF-a诱导的ICAM-1和VCAM-1蛋白和mRNA表达、P-selectin和E-selectin mRNA表达以及U937单核细胞与HUVEC的黏附；NaHS剂量依赖性诱导HO-1表达,同时NaHS还能够在TNF-α刺激的HUVEC中剂量依赖性诱导HO-1表达；NaHS剂量依赖性的抑制TNF-α诱导的ROS产生NF-kB激活(通过IκBα的降解以及NF-κB p65磷酸化和核转位评价)；2NaHS显著抑制心肌梗死后3、14天的ICAM-K VCAM-K TNF-a和iNOS的mRNA的表达以及心肌梗死后3天的CD68+炎症细胞浸润、NF-κB的激活、TLR2、ICAM-1(?)口iNOS表达,而PAG则部分的加重心肌梗死后炎症反应；NaHS显著改善心功能、缓解心肌重构及纤维化并推动新生血管,PAG则加重心肌重构及纤维化并抑制血管新生；NaHS显著推动心肌梗死后HO-K CSE以及VEGF表达；并可激活存活通路Akt,并抑制p38通路的激活；在体外培养的原代心肌成纤维细胞中,NaHS可抑制(?)Ang Ⅱ诱导的MMP-2、MMP-9、Ⅰ型胶原和Nox4表达,同时NaHS还能够抑制p38通路的激活；3SPRC剂量依赖性的抑制TNF-a诱导的ICAM-1和VCAM-1蛋白表达和U937单核细胞与HUVEC的黏附；同时SPRC可显著诱导TNF-α刺激的HUVEC细胞中CSE表达；SPRC有效抑制TNF-a诱导的细胞内ROS产生、JNK1/2激活、IκBcα的降解以及NF-κB p65磷酸化和核转位；4SPRC剂量依赖性抑制LPS诱导的iNOS诱导的CAM-1mRNA和Ⅰ(?)NF-α mRNA表达和蛋白；SPRC剂量依赖性的激活磷酸肌醇-3-激酶(phosphoinositide3-kinase, PI3K)/Akt通路；SPRC有效抑制LPS诱导的ERK1/2激活、IκBα的降解以及NF-κB p65磷酸化、细胞内ROS产生。[结论]1.外源性H2S能有效的抑制TNF-a诱导的血管内皮细胞炎症反应,其机制与上调HO-1表达、抑制NF-κB激活相关；2.外源性H2S可抑制急性心肌梗死引起的炎症反应,其机制至少与抑制NF-κB信号通路而抑制炎症反应相关；外源性H2S可显著改善心肌功能,其作用与H2S抑制心肌重构、纤维化、推动血管新生相关；3.SPRC(?)(?)通过抑制TNF-α诱导的黏附分子(ICAM-1、VCAM-1)表达而抑制U937单核细胞与内皮细胞的黏附,其机制与调节CSE表达、抑制NF-κB信号通路相关；4. SPRC能通过抑制LPS诱导的H9c2心肌细胞炎症反应,其机制与调节CSE/H2S系统、激活P13K/Akt通路、抑制NF-κB信号通路相关。关键词：硫化氢论文炔丙基半胱氨酸论文脂多糖论文肿瘤坏死因子论文心肌缺血论文H9c2心肌细胞论文黏附分子论文心肌重构论文内皮细胞论文
中文摘要5-8
Abstract8-11
英文缩写与中文对照11-13
前言13-15
第一部分 硫化氢抗TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞的炎症反应探讨15-38
材料和策略16-27
结果27-36
讨论36-38
第二部分 硫化氢对心肌缺血大鼠的保护作用及其机制探讨38-69
材料和策略39-45
结果45-66
讨论66-69
第三部分 炔丙基半胱氨酸抗TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞的炎症反应探讨69-81
材料和策略70-72
结果72-79
讨论79-81
第四部分 炔丙基半胱氨酸抗脂多糖诱导的H9c2心肌细胞炎症反应探讨81-102
材料和策略82-87
结果87-100
讨论100-102
总结与展望102-104