摘要：先天性免疫系统是机体识别和清除入侵病原体的第一道防线，具有作用广泛、启动迅速的特点，在保护机体、抵抗感染的历程中具有极其重要的作用。先天性免疫应答的激活主要通过宿主的方式识别受体(PRRs)识别病原微生物的病原相关分子方式(PAMPs)，进而招募相应的接头蛋白，激活信号级联反应，诱导I型干扰素、促炎细胞因子、趋化因子的分泌和表达，以而杀伤和清除病原微生物。针对不同的病原相关分子方式，机体有不同的方式识别受体应答。目前发现的方式识别受体包括三种：TLRs、RLRs和NLRs。它们可以通过激活NF-B和IRF等转录因子推动I型干扰素等基因的转录，也可以通过起始胞浆内炎症小体复合物(inflammsome)的组装推动促炎细胞因子的成熟与释放。炎症小体由受体蛋白，接头蛋白ASC和效应分子pro-caspase-1构成。宿主炎症小体的功能状态与病原微生物的致病性密切相关，一方面炎症小体的适度激活具有杀灭病原体以及抑制感染的作用；另一方面，过度的炎症反应会导致多种组织和器官伤害，甚至危及生命。由此，炎症小体需要精准的调控，鉴定和筛选新的炎症小体调控分子对于抵抗病原微生物感染具有十分重要的作用。凋亡相关点状蛋白ASC作为炎症小体信号通路中关键的接头蛋白，在信号传递历程中必不可少。它通过PYRIN和CARD结构域连接受体蛋白和pro-caspase-1，使pro-caspase-1切割为有活性的caspase-1，最终推动IL-1和IL-18等成熟和分泌。鉴于ASC在炎症小体介导的细胞因子成熟历程中的重要作用，我们将其作为靶点筛选参与炎症小体激活的新调控分子，通过酵母双杂交实验发现线粒体抗病毒信号蛋白MS有可能和ASC相互作用，进一步探讨表明：1. MS与ASC发生相互作用：通过免疫共沉淀、GST-pulldown、线粒体分离、免疫荧光、免疫印迹等策略，发现MS与ASC在体内外形成复合物；通过构建截短突变体等策略，发现MS通过CARD和TM结构域与ASC的CARD结构域相互作用。2. MS通过上调ASC的蛋白稳定性推动其介导的IL-1产生：ELISA结果表明，MS能推动ASC介导的IL-1产生，该现象依赖于MS的CARD结构域、TM结构域及其二聚化；免疫印迹结果表明，过表达的MS能上调ASC的蛋白水平，敲低细胞内源MS的表达导致ASC的蛋白水平降低；RT-PCR结果表明，MS不影响ASC的mRNA水平。3. MS通过E3泛素连接酶TRAF3调控ASC：通过筛选6种与MS密切相关的E3泛素连接酶，发现TRAF3可以增强ASC的蛋白稳定性及其介导的IL-1水平；进一步探讨表明，TRAF3能与ASC相互作用并使其泛素化，而丧失了E3连接酶功能的TRAF3(C53AC56A)和TRAF3(C68AH70A)突变体不能泛素化ASC；在TRAF3knockdown细胞中，MS不能显著上调ASC的蛋白稳定性。4. TRAF3催化ASC K174位发生K63-连接的泛素化：通过构建一系列Ub的KR突变体，发现TRAF3催化ASC发生K63-连接的泛素化；通过构建一系列ASC的KR突变体，发现ASC第174位赖氨酸是可能的泛素化位点；与野生型ASC相比，ASC(K174R)突变体的蛋白稳定性及其介导的IL-1水平均不受MS与TRAF3的影响。5.病毒感染后ASC的核质穿梭依赖于TRAF3对其泛素化修饰：VSV感染后，ASC出现显著的泛素化修饰与核质穿梭；与野生型细胞相比，在MS与TRAF3knockdown细胞中，病毒感染引起的ASC的泛素化修饰水平降低，核质穿梭现象减弱。核质分离和免疫荧光实验表明，病毒感染后，TRAF3推动野生型ASC由细胞核向细胞质转移，而对ASC(K174R)突变体的细胞定位无显著影响。6.病毒感染后MS与TRAF3推动炎症小体的激活：与野生型MEF细胞相比，在MS-/-与TRAF3-/-细胞中，SeV感染诱导的pro-caspase-1的切割减弱、IL-1水平下降；用VSV分别感染野生型与MS-/-小鼠的BMDC细胞后，MS-/-细胞中pro-caspase-1的切割程度与caspase-1的酶活性均低于野生型细胞。综上所述，本探讨发现MS通过E3泛素连接酶TRAF3，上调ASC的蛋白稳定性，推动其介导的IL-1产生。TRAF3催化ASC发生K63-连接的泛素化修饰，修饰的可能位点为ASC第174位赖氨酸。进一步探讨表明，ASC的泛素化能介导病毒感染诱导的核质穿梭，在此基础上推动炎症小体的激活。本探讨不但鉴定了新的炎症小体调控因子，阐明了MS与TRAF3调控炎症小体的分子机制，同时也为揭示不同信号转导途径之间的交联机制提供了重要的论述依据。关键词：MS论文TRAF3论文ASC论文炎症小体论文泛素化论文
缩略词表5-6
中文摘要6-8
英文摘要8-11
前言11-27
1. RLRs 介导的 I 型干扰素抗病毒信号通路11-17
1.1 RIG-I 样受体(RLRs)12
1.2 MS 是 RLR 通路中关键的接头蛋白12-17
2. NLRs 介导的炎症小体信号通路17-25
2.1 炎症小体介绍17-19
2.2 ASC 是炎症小体信号通路中重要的接头蛋白19-22
2.3 炎症小体的激活22-25
2.4 炎症小体与疾病25
3. 本课题探讨的科学不足25-27
材料与策略27-37
1. 材料27-28
1.1 细胞株27
1.2 菌株与质粒27
1.3 常用试剂盒27
1.4 分子生物学及细胞生物学试剂27
1.5 抗体27-28
1.6 其它化学试剂28
1.7 主要实验仪器28
2. 实验策略28-37
2.1 细胞总 RNA 的提取28-29
2.2 反转录 PCR29
2.3 载体构建、引物合成及测序29
2.4 细胞培养、冻存和复苏29-30
2.5 真核细胞的转染30
2.6 GST-pull down30-31
2.7 免疫印迹31
2.8 免疫沉淀31-32
2.9 免疫荧光32
2.10 核质分离32
2.11 线粒体分离32-33
2.12 ELISA33
2.13 分子筛渗透层析33-34
2.14 小鼠 BMDC 的分离34
2.15 Caspase-1 活性检测34-37
结果37-63
1. MS 与 ASC 相互作用37-41
1.1 MS 与 ASC 在体内外相互作用37-39
1.2 MS 与 ASC 相互作用的结构域39-41
2. MS 增强 ASC 的蛋白稳定性及其介导的 IL-1 水平41-45
2.1 MS 增强 ASC 介导的 IL-1 水平41-42
2.2 MS 增强 ASC 的蛋白稳定性42-45
3. MS 通过 TRAF3 调控 AS5-51
3.1 TRAF3 增强 ASC 介导的 IL-1 水平45-46
3.2 TRAF3 催化 ASC 发生泛素化46-47
3.3 TRAF3 与 ASC 相互作用47-48
3.4 TRAF3 增强 ASC 的蛋白表达水平48
3.5 TRAF3 影响 ASC 的半衰期48-49
3.6 MS 对 ASC 的调控依赖于 TRAF349-51
4. TRAF3 催化 ASC K174 位发生 K63-连接的泛素化51-54
4.1 TRAF3 催化 ASC 发生 K63-连接的泛素化51-52
4.2 TRAF3 催化 ASC K174 位发生泛素化52-54
5. 病毒感染后 TRAF3 对 ASC 的泛素化介导其核质穿梭54-59
5.1 病毒感染后 ASC 发生泛素化54-55
5.2 MS 与 TRAF3 参与病毒感染后 ASC 的泛素化历程55-56
5.3 病毒感染后 TRAF3 推动 ASC 由细胞核向细胞质转移56-58
5.4 病毒感染后 ASC(K174R)无显著核质穿梭58-59
6. 病毒感染后 MS 与 TRAF3 推动炎症小体激活59-63
6.1 病毒感染后 MS 与 TRAF3 推动 pro-caspase-1 切割和 IL-1β 产生59-61
6.2 病毒感染后 TRAF3 与 ASC 形成大分子复合物61-63
讨论63-69
1. MS 与 ASC 形成复合物63-64
2. MS 增强 ASC 的蛋白稳定性及其介导的 IL-1 水平64-65
3. MS 通过 TRAF3 对 ASC 的泛素化调控炎症小体信号通路65-66
4. MS 与 TRAF3 参与病毒感染后炎症小体的激活66-69
结论69-71
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