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摘要：背景和目的排斥反应是导致移植后器官功能丧失的最主要理由，是移植物长期存活的主要障碍。探寻安全有效的抗原特异性免疫抑制策略，以实现移植物长期存活是器官移植领域最重要的任务之一，尽管近几年各种免疫抑制剂的合理利用，有效的降低了器官排斥，增加了器官移植的成功率，对器官移植患者的长期存活和移植物保持良好功能都起着重要作用，但免疫抑制剂同时有自身不可克服的缺陷—抑制机体正常免疫功能。口服耐受是机体免疫系统对肠道接触的大量食物抗原和各种微生物形成的不反应状态，是后天条件下机体维持对必须进入机体的外来抗原(食物抗原，肠道共生菌抗原)耐受的后天机制。其中，以肠系膜淋巴结为主的肠道淋巴系统中的调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)在上面陈述的耐受形成中起着至关重要的作用。体内CD4+CD25+Treg是一群具有重要免疫调节功能的细胞，对效应性T细胞的活化和增殖起负调控作用；同时在器官移植后促使机体内免疫平衡向耐受状态进展并维持耐受状态中起着极其重要的作用。有效利用机体自身CD4+CD25+Treg调节移植术后异体移植物与受者间免疫功能调节能避开免疫抑制剂带来的副作用。我们知道，exosome是多种活细胞晚期内体以胞吐的方式分泌到细胞外形成，且不同细胞来源的exosome具有不同免疫功能，例如DC来源的exosome和B细胞来源的exosome富含MHC II分子和共刺激分子(CD86、CD80)，是T细胞活化的必需共刺激分子；人类鼻咽癌来源的exosome含latent membrane protein gene1(LMP1)，能抑制T细胞活化效应；某些肿瘤来源的exosome能异常地表达Fas pgand (FasL)，诱导活化的细胞死亡(activated induced cell death，AICD)。现已证实B细胞，T细胞，树突状细胞(DendriticCells，DC细胞，肥大细胞和多种肿瘤细胞等均能分泌exosome。那么CD4+CD25+Treg细胞是否也能分泌exosome，并通过其进行远端调控？为证实这一设想，我们通过口服RDP58肽与霍乱毒素B型亚单位(cholera toxin B subunit，CTB)的交联物诱导肠内CD4+CD25+Treg细胞，并收集到CD4+CD25+Treg源性exosome。材料和策略本实验旨在收集口服RDP58与CTB交联后的产物诱导的特异性CD4+CD25+Treg细胞分泌的exosome，并建立大鼠急性肾移植模型后，过继转移入CD4+CD25+Treg细胞源性exosome，体内观察exosome对移植肾存活时间、肾功能及移植肾病理组织学变化的影响；体外通过混合淋巴细胞培养，观察其对T淋巴细胞增殖的影响。最后通过SDS-Page和质谱系统(High Performance Liquid Chromatography-CHIP-MassSpectrometer, Hplc-CHIP-MS)对CD4+CD25+Treg源性exosome囊泡内所含蛋白的组成进行检测与浅析：(1)人工合成RDP58肽，并完成其分子量及纯度检测；(2)用交联剂SPDP交联RDP58衍生肽与CTB，用HPLC纯化后并进行检测；(3)建立大鼠肾移植模型，观察RDP58-CTB交联物口服后，对异体肾移植排斥的抑制效果，以而验证RDP58肽结构被衍生后，其功能学的变化；(4)口服灌胃RDP58-CTB交联物，诱导肠系膜特异性CD4+CD25+Treg细胞；(5)收集肠系膜淋巴结，流式分选收集CD4+CD25+Treg细胞，培养1-2周后，取上清液超速离心和密度梯度离心法收集exosome；(6)建立大鼠肾移植模型，过继转移入CD4+CD25+Treg源性exosome，并观察其在体内及体外的生物学功能；(7)Exosome蛋白质谱浅析：SDS-Page法和HPLC-CHIP-MS法来观察exosome囊泡内蛋白数量和种类。结果1、人工合成RDP58肽和衍生RDP58肽，纯度均达95%以上，并用交联剂SPDP，完成RDP58衍生肽与CTB的交联；2、用prolene滑线作内支架法建立大鼠肾移植模型，可有效提升手术成功率和减少缺血时间；3、口服交联产物RDP58-CTB后能有效提升机体HO-1活性和抑制T淋巴细胞增殖，相对单独运用RDP58而言能显著改善移植肾存活时间和病理组织变化，并达到与腹腔注射RDP58相同的治疗效果；4、超滤法和密度梯度法收集到CD4+CD25+Treg细胞源性exosomes，电镜下可见其为30-100nm均匀圆形小体,密度为1.13to1.21g/ml (漂浮在30%蔗糖/D2O中)；5、过继转移入CD4+CD25+Treg细胞源性exosomes后，体内实验有效延长移植肾存活时间、改善移植肾肌酐和尿素氮水平和组织学病理变化；体外能抑制T淋巴细胞增殖；6、用SDS-polyacrylamide gel (SDP-Page)电泳初步观察Exosome中蛋白组成数量，并进一步行蛋白质谱浅析，证实有数十种蛋白组成，包括cap adenylylcyclase-associated protein1、ldha L-lactate dehydrogenase A chain等蛋白。结论1、 RDP58肽与CTB交联后，能有效提升抗原免疫原性，在体内提升HO-1活性，延长移植肾存活时间；其治疗效果与腹腔注射相同，但口服途径诱导耐受有无可比拟的安全性和方便性；2、 CD4+CD25+Treg细胞能分泌exosomes，且exosomes过继转移入大鼠急性肾排斥模型后，能显著改善移植肾存活时间和病理组织变化，这可能是CD4+CD25+Treg细胞实现远端调控的重要机制之一；3、 Exosome经SDS-PAGE和蛋白质谱浅析，证实是由十余种蛋白组成的的囊泡状结构。关键词：RDP58论文CD4+CD25+Treg论文exosome论文肾移植论文
英文缩写一览表6-9
Abstract9-12
摘要12-15
前言15-17
第一部分 RDP58 肽合成及与 CTB 交联17-28
材料和策略17-18
结果18-22
讨论22-24
小结24-25