本站原创
摘要：膜片钳技术是上个世纪90年代初兴起的一种记录细胞膜离子通道电生理特性的技术,它为了解生物膜离子通道的门控动力学特点以及通透性等提供了最直接的手段。在神经科学领域,膜片钳技术多用于探讨神经元上离子通道的分布特点和功能特性。大多数的膜片钳记录是在胞体上进行的。神经元的另一重要结构——树突,因其直径较小,一直以来限制树突膜片钳技术的操作。然而,树突接受大多数投射到神经元的突触传入,其上分布着大量不同类型的离子通道,是突触整合、突触可塑性调节的重要位点,具有重要的生理功能。由此在树突上进行直接的膜片钳记录,将为进一步了解树突的兴奋性特点提供新的机会。我们在成功进行胞体膜片钳记录的基础上对树突膜片钳记录进行了摸索。我们的实验以海马脑片为标本,在微分干涉相衬(Differential interference contrast, DIC)显微镜下观察到健康的CA1区锥体神经元的树突后操作的。虽然树突记录的基本操作技术类似于胞体记录,但与后者相比,树突记录需要更高的精确度。经过多次尝试,我们发现,要提升树突记录的成功率,需要注意的主要有以下几个方面：利用最优化的膜片钳设备；提升脑片质量,以看到更多适合封接的健康树突；电极尖端直径的大小要合适,过大过小都会影响树突的封接；电极接触树突的方式要正确,不可过度；破膜时所用负压要适度,也可采取电击破或强超极化的方式破膜。我们在CA1区锥体神经元的胞体和顶树突同时记录,探讨树突的被动特性和主动特性。实验中,我们分别在顶树突的不同位点,给予相同大小的兴奋性突触后电流(Excitatory postsynaptic current, EPSC)样注电流,在胞体和顶树突同时记录。结果发现,树突注电流位点距离胞体越远,产生的树突局部兴奋性突触后电位(Excitatory postsynaptic potential, EPSP)幅度越大,而同时在胞体记录的EPSP(?)的幅度则更小,Half-width与Rise time则更长。实验结果说明由于树突本身的特性,同样大小的注电流在树突较远端产生的EPSPi幅度比在较近端产生的大,而且EPSP在向胞体传递的历程中幅度逐渐衰减,持续时间逐渐延长。我们换用玻璃电极刺激海马CA1区的辐射层(Stratum radiatum, SR),分别在不同的树突位点和胞体同时记录,得到一致的结果。由此我们得出结论：EPSP的传递效率依赖突触传入的位点。为观察EPSP由胞体向树突方向的传递情况,我们在胞体给予一定大小的EPSC-样注电流,分别在树突不同位点和胞体同时记录。结果发现,EPSP在向树突传递的历程中,幅度逐渐衰减,Half-width与Rise time逐渐增加。基底树突直径非常小,一方面要求封接基底树突所用的电极尖端直径更精细,同时也需要更精确的封接策略,由此大大增加了封接的难度。我们在多次失败经验的基础上终于在基底树突记录到电流。在获得高质量树突记录的基础上,我们打算对不同树突来源的两个EPSP的整合机制进行探讨。我们用玻璃电极与金属电极同时刺激海马CA1区的SR和始层(Stratum oriens, SO),-10ms的时间窗(SO刺激在SR刺激之前10ms)以10Hz的频率,将顶树突EPSP与基底树突EPSP配对诱导60次,结果发现EPSP的长时程增强(Long-term potentiation, LTP)现象。同样的protocol下,+10ms时获得EPSP的长时程抑制现象(Long-term depression, LTD)。我们计划借助顶树突与胞体、胞体与基底树突同时记录的策略探讨顶树突EPSP与基底树突EPSP整合的机制。关键词：树突膜片钳记录论文树突特性论文长时程突触增强论文长时程突触抑制论文
摘要5-7
Abstract7-10
前言10-14
材料14-21
1 材料准备14
2 电生理记录14-21
操作策略一21-30
脑片制备21-24
观察树突24-25
树突记录25-30
操作策略二30-35
结果35-47
1. EPSP沿顶树突向胞体的传递35-38
2. 胞体EPSP向树突的传递38-41
3. EPSP传递效率对突触位置的依赖性41-43
4. 基底树突记录43-44
5. 不同树突来源的兴奋性输入的整合44-46
下步实验计划46-47
讨论47-52