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摘要：主动脉夹层(aortic dissection, AD)是累及主动脉的灾难性疾病,一旦破裂致死率极高。近年来在我国和世界范围内,AD的发病率和检出率正逐年上升,消耗了大量的医学资源与社会财富。既往探讨表明,高血压、动脉粥样硬化、吸烟等诸多因素与AD的发生相关,但目前仍缺乏具有说服力的发病检测说和机理,其确切的发病机制仍未彻底探讨清楚。大量病理探讨显示,AD患者的主动脉中膜有着不同程度的平滑肌细胞(ooth muscle cell, C)坏死、凋亡及表型转化,并伴有细胞外基质(extracellular matrix, ECM)成分异常和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)表达上调,这提示主动脉壁的结构转变可能是AD发病的始动因素,而高血压等外因在管壁结构失衡的基础上,加速或者推动了AD的发生。多囊肾病基因-1(PKD1)编码的蛋白产物为多囊蛋白-1(polycystin-l,PC-l),后者参与细胞黏附和细胞信号转导。国外学者在采取PKD1敲除的小鼠模型进行实验时发现：PKD1的表达下调导致了模型小鼠的主动脉形成潜在间隙和壁间血肿等一系列类似AD发生前的结构转变。我们前期的探讨也发现AD患者主动脉中膜的PKD1表达显著下调。由此本课题在组织水平和细胞水平探讨PKD1表达下调、C表型转化、ECM代谢异常与AD形成之间的联系,以阐明PKD1表达下调推动AD发生的机制,为AD的早期诊断、治疗与预防奠定论述基础,推动更深一步的探讨。第一部分主动脉夹层胸主动脉中膜C表型和ECM代谢的体内实验探讨目的观察及评估夹层累及的胸主动脉中膜和正常胸主动脉中膜在C表型、ECM成分和MMP表达上的差别。策略采集AD患者的病变胸主动脉标本和正常成人胸主动脉标本各18例,分为AD组和正常组,两组的性别构成比相同且平均年龄无显著差别(P0.05)。运用免疫组织化学染色和Western blot检测两组标本中膜的C表型蛋白的表达,透射电镜(tranission electron microscope, TEM)观察C的超微结构,特殊病理染色、免疫组织化学染色及Western blot测定中膜弹性蛋白、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白、MMP-1和MMP-2的含量。结果与正常组相比：①免疫组织化学染色和Western blot显示AD组中膜的平滑肌α-肌动蛋白(ooth muscle a-actin, a-A)、平滑肌肌球蛋白重链-2(ooth muscle myosin hey chain2, -MHC-2)、 Smoothepn及Calponin(均为C收缩表型的标志蛋白)的表达显著降低(P0.01),而骨桥蛋白(osteopontin, OPN))和非肌型肌球蛋白重链(non-muscle myosin hey chain B, emb)(均为C合成表型的标志蛋白)的表达显著增加(P0.01)。②透射电镜显示在病变胸主动脉中膜内,C失去典型的长梭形,胞质内含有丰富的粗面内质网和高尔基体等合成蛋白的细胞器,肌丝、密体等收缩结构则显著减少或消失。③asson染色和Gomori氏染色显示胶原纤维大量沉积于病变胸主动脉中膜,而弹力纤维出现断裂、减少和消失；免疫组化染色显示病变中膜的Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白含量显著增加(P0.01)。④免疫组化和Western blot结果显示,MMP-2在病变中膜的表达量显著增加(P0.01),而MMP-1的表达量与正常组相比无显著差别(P0.05)。结论在AD患者的病变胸主动脉中膜,C的表型以收缩型向合成型转化。在C表型转化的同时亦伴有弹性蛋白的显著降解、胶原蛋白的大量沉积和MMP-2的表达上调。第二部分正常和病变胸主动脉中膜C的体外培养及鉴定目的以AD患者的病变胸主动脉及正常胸主动脉中分离、培养、扩增及鉴定中膜C,建立简单有效的原代C培养系统。策略病变胸主动脉标本和正常成人胸主动脉标本各18例(即第一部分实验的标本),随机分成酶消组、贴块组和改良贴块组,每组病变和正常标本各6例,分别采取酶消法、组织贴块法及改良组织贴块法分离和培养中膜C。通过台盼蓝染色检测每组细胞活力,免疫细胞化学染色鉴定每组细胞纯度。结果①酶消组正常中膜C的培养成功率为50%(3/6),病变中膜C则无一例培养成功(0/6)；贴块组正常中膜C的培养成功率为100%(6/6),病变中膜C的培养成功率为66.7%(4/6)；改良贴块组正常和病变中膜C的培养成功率均为83.3%(5/6)。②酶消法培养原代C,5-6d后即可传代；经改良组织贴块法培养的原代C,以细胞萌出至融合传代需10-12d；组织贴块法的细胞培养周期需4w。③三组正常中膜的原代C均体现为典型的长梭形或三角形,胞浆丰富,生长至融合状态时呈现出“峰谷”样排列,传代后的细胞形态和排列与原代细胞保持一致；而通过贴块法和改良贴块法获得的病变中膜原代C,其大多数细胞形态与正常C无异,但部分细胞体现为卵圆形或多边形的特殊形态,胞质疏松,在传代后的细胞系中亦可见到特殊形态的C聚集。④三组正常中膜C的vWF和CD90/Thy-1染色均为阴性,a-A染色平均阳性率均95%(P0.05),OPN染色平均阳性率均10%(P0.05)；在贴块组和改良贴块组中,病变中膜C的a-A染色平均阳性率分别为16±2.6%和15±3.1%(P0.05),OPN染色平均阳性率分别为85±4.3%和88±1.7%(P0.05),vWF和CD90/Thy-1染色亦均为阴性。结论与传统的酶消法和组织贴块法相比,改良组织贴块法是简单、有效的AD和正常主动脉中膜C的培养策略,所获得的原代C可在体外连续传代,且无血管内皮细胞和成纤维细胞的污染。与正常中膜C相比,体外培养的部分病变中膜C体现为特殊的细胞形态。第三部分主动脉夹层胸主动脉中膜C表型转化影响ECM代谢的实验探讨目的体外鉴定正常和病变中膜C的表型,并评估两组C在胶原蛋白合成和MMP表达上的差别。策略采集AD患者的病变胸主动脉标本和正常成人胸主动脉标本各6例(即第一部分实验标本),通过改良贴块法建立C细胞系,分成AD组和正常组,每组细胞系各6例。细胞增殖实验检测两组C的体外增殖速度和DNA合成能力,免疫荧光染色、Western blo、 real-time RT-PCR检测C表型蛋白的表达,TEM观察体外培养的C的超微结构,脯氨酸掺入法测定C的Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白合成量,Western blot检测C的MMP-1和MMP-2的表达量。结果与正常组C相比：①AD组C的体外增殖能力显著提升(P0.01)。②AD组C的a-A、 -MHC-2及Smoothepn在mRNA水平和蛋白水平上的表达量均显著减少(P0.01),而OPN的表达量显著增加(P0.01)。③AD组C的内质网和高尔基体显著增加、扩张,肌丝则显著减少或消失。④AD组C的Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白合成量显著增加(P0.01)。⑤AD组C的MMP-2表达量显著增加(P0.01),而MMP-1的表达量与正常组相比无显著差别(P0.05)。结论与体内实验结果一致,体外培养的AD主动脉中膜C也显示了以收缩表型向合成表型的转化。随着C表型转化,其胶原蛋白的合成及MMP-2的表达增加。第四部分PKD1表达下调影响C表型的实验探讨目的体内外检测PKD1在正常和病变主动脉中膜C内的表达,评估PKD1表达下调对C表型、胶原蛋白合成和MMP-2表达的影响。策略AD患者的病变胸主动脉标本和正常成人胸主动脉标本各18例(即第一部分实验标本),分成AD组和正常组,免疫组织化学染色和Western blot检测两组中膜的PKD1表达。通过改良贴块法建立C细胞系,分为对照组、AD组和干扰组,对照组和干扰组C来源于正常中膜,AD组C来源于病变中膜,每组细胞系各4例。筛选有效消减内源性PKD1的RNA干扰(RNA interference, RNAi)片段,包装入慢病毒载体构建PKD1干扰工具,转染干扰组C,检测C内的PKD1消减效率。通过Western blo、 real-time RT-PCR和脯氨酸掺入法检测对照组、AD组以及PKD1干扰后的干扰组C的表型蛋白和MMP-2的表达、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的合成。结果(1)体内实验结果显示,与正常组相比,AD组中膜PKD1的表达量显著减少(P0.01)。(2)体外实验结果显示,与对照组C相比,PKD1干扰后的干扰组C内：①KD1的表达量显著减少(P0.01)；②α-A, -MHC-2和Smoothepn的表达量均显著减少(P0.01),而OPN的表达量显著增加(P0.01)；③Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的合成显著增加(P0.01)；④MMP-2的表达量显著增加(P0.01)；与AD组C相比,PKD1干扰后的干扰组C内：①PKD1表达量显著增加(P0.01)；②α-A和Smoothepn的表达量均显著增加(P0.05),OPN的表达量显著减少(P0.01),-MHC-2在mRNA水平上的表达量差别不显著(P0.05),在蛋白水平上的表达量显著增加(P0.05)；③Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的合成显著减少(P0.01)；④MMP-2的表达量显著减少(P0.01)。结论与正常主动脉中膜C相比,AD主动脉中膜C内的PKD1表达显著降低。体外干扰正常中膜C内的PKD1表达后,和AD中膜C相似,正常中膜C也发生了以收缩表型向合成表型的转化,其胶原蛋白的合成以及MMP-2的表达也增加。关键词：主动脉夹层论文平滑肌细胞论文细胞外基质论文基质金属蛋白酶论文PKD1论文表型转化论文RNA干扰论文
中英文词汇对照表4-5
中文摘要5-9
Abstract9-14
引言14-16
第一部分 主动脉夹层胸主动脉中膜C表型和ECM代谢的体内实验探讨16-44
前言16
材料与策略16-27
结果27-40
讨论40-43
结论43-44
第二部分 正常和病变胸主动脉中膜C的体外培养及鉴定44-62
前言44
材料与策略44-51
结果51-58
讨论58-61
结论61-62
第三部分 主动脉夹层胸主动脉中膜C表型转化影响ECM代谢的实验探讨62-82
前言62
材料与策略62-72
结果72-78
讨论78-81
结论81-82
第四部分 PKD1表达下调影响C表型的实验探讨82-105
前言82
材料与策略82-95
结果95-102
讨论102-104
结论104-105
全文结论105-106