摘要：泥鳅(Misgurnus anguilpcaudatus)是一种小型淡水经济鱼类,广泛分布于我国辽河以南大部分地区以及越南、朝鲜和日本等地。由于其肉质细嫩味美、营养丰富,目前已成为我国一个重要的名优养殖品种。近年来,由于过度捕捞、大量人工养殖和水域生态环境日益恶化,我国野生泥鳅的种质资源逐渐衰退,如：生长慢、性成熟早、个体变小以及抗病能力下降等。长江流域是我国泥鳅的主要分布区,对该流域不同泥鳅群体的遗传多样性进行探讨,正确评估野生泥鳅的种质资源情况和遗传差别显得非常重要。本探讨选用鱼类线粒体DNA ND-5/6区段的通用引物对该区段进行PCR扩增,利用PCR-RFLP标记对长江流域不同泥鳅群体的遗传多样性进行浅析。主要结果如下：(1)利用PCR-RFLP标记对武汉和岳阳两地同域分布二倍体和四倍体泥鳅的遗传联系进行了探讨。对长江流域7个地区野生泥鳅的倍性进行检测,只检测到二倍体和四倍体,其中武汉、岳阳两地同域分布有二倍体和四倍体泥鳅。mtDNAND-5/6区段PCR扩增结果显示,二倍体和四倍体的扩增产物长度都为2.2 kb左右。对武汉和岳阳两地的二倍体和四倍体泥鳅做进一步的PCR-RFLP浅析,利用筛选出的6种内切酶(HaeⅢ,DraⅠ, RsaⅠ,TaqⅠ, HinfⅠ和MspⅠ)对扩增产物进行酶切,共检测到66种单倍型。泥鳅群体内单倍型多样性和核苷酸多样性分别为0.7679-0.9385和0.01041-0.03212,其中岳阳二倍体核苷酸多样性最高(0.03212),武汉二倍体其次(0.02452),二倍体群体内核苷酸多样性高于四倍体。群体间的核苷酸多样性(π)大小为0.02588-0.04144,平均值为0.031737±0.000005。群体间的核苷酸歧化距离(δ)大小为0.00462-0.01617,平均值为0.010659±0.000003,其中武汉二倍体和四倍体之间的核苷酸歧化距离最大(0.01617),武汉四倍体和岳阳二倍体之间的核苷酸歧化距离最小(0.00462)。Monte Carlo模拟χ2检验表明,4个群体间的单倍型频率有着极显著差别(P0.0001)。UPGMA聚类浅析表明,武汉四倍体、岳阳二倍体和四倍体聚为一支、亲缘联系较近,武汉二倍体为单独一支。(2)利用PCR-RFLP标记对长江流域乐山、重庆、宜昌、岳阳、武汉、安庆、南京7个二倍体泥鳅群体219尾个体进行了遗传多样性浅析。结果显示：扩增得到的产物大小约为2.2 kb,未发现扩增加度多态现象。以13种内切酶(BamHⅠ,DraⅠ, EcorⅠ, HindⅢPstⅠ, MspⅠ,HaeⅢ,HinfⅠ,TaqⅠ,RsaⅠ,MvaⅠ, PvuⅠ, HhaⅠ)中进行筛选,发现有11(BamHⅠ, DraⅠ, EcorⅠ,HindⅢPstⅠ, MspⅠ,HaeⅢ, HinfⅠ,TaqⅠ, RsaⅠ, MvaⅠ)种酶的多态性较好。通过酶切浅析一共得到91种单倍型,其中南京群体的单倍型多样性最高(0.8927),其次是岳阳群体(0.8627),四川乐山群体最低(0.2603)。7个二倍体泥鳅群体的平均单倍型多样性指数为0.7410±0.00693(自交)、0.7302±0.00671(非自交),平均核苷酸多样性指数为0.078624±0.0000092；群体间的核苷酸歧化距离(δ)大小为0.012712-0.085330,平均值为0.043122±0.0000142,其中武汉和岳阳群体之间的核苷酸歧化距离最小(0.01617),武汉和乐山群体之间的核苷酸歧化距离最大(0.085330)。Monte Carlo模拟χ2检验表明,7个群体间的单倍型频率有着极显著差别(P0.0001)。UPGMA和NJ聚类浅析表明,武汉和岳阳两个群体的亲缘联系最近,它们与宜昌、南京和安庆群体聚在一起成为一支；乐山和重庆群体亲缘联系较近,聚为另一支。这表明长江上游与长江中下游流域的二倍体泥鳅群体有着较大的遗传分化。通过对不同泥鳅群体的遗传多样性浅析,表明长江流域的野生泥鳅多样性比较丰富,具有较好的开发利用潜力。在泥鳅的人工养殖和繁育历程中,应加强野生泥鳅种质资源和遗传多样性的保育,保障泥鳅资源的持续、合理利用。关键词：泥鳅论文二倍体论文四倍体论文遗传多样性论文PCR-RFLP论文mtDNA论文ND-5/6论文
摘要7-9
ABSTRACT9-11
第1章 文献综述11-26
1 本实验的探讨背景11-12
2 遗传多样性的探讨12-16
2.1 鱼类多样性概况13
2.2 遗传多样性探讨与进展13-16
2.2.1 形态学水平13-14
2.2.2 细胞学水平14
2.2.3 蛋白质水平14-15
2.2.4 分子水平15-16
3 分子标记技术在鱼类多样性探讨中的运用16-21
3.1 分子标记的进展16-20
3.2 RFLP在鱼类多样性探讨中的运用20-21
4. 线粒体DNA在鱼类多样性探讨中的运用21-23
4.1 鱼类线粒体DNA的结构21-22
4.1.1 鱼类线粒体DNA序列组成21-22
4.1.2 鱼类线粒体DNA特点22
4.2 线粒体DNA的运用22-23
5 本探讨的目的和作用23-24
6 本探讨的技术路线24-26
第2章 同域分布的二倍体和四倍体泥鳅ND5/6基因多态性及群体遗传变异的PCR-RFLP浅析26-42
1 材料与策略26-32
1.1 样本采集26-27
1.2 溶液配制27-28
1.2.1 检测倍性所需试剂的配制27
1.2.2 DNA提取所需试剂的配制27-28
1.2.3 琼脂糖胶的制备及电泳所需试剂的配制28
1.3 实验策略28-32
1.3.1 泥鳅倍性的流式细胞仪检测步骤28
1.3.2 DNA的提取28-29
1.3.3 DNA浓度的测定29
1.3.4 DNA质量的电泳检测29
1.3.5 PCR扩增29-31
1.3.6 限制性核酸内切酶单酶酶切和电泳31-32
1.3.7 数据处理和浅析32
2 结果与浅析32-38
2.1 倍性检测结果32-33
2.2 基因组DNA的检测33-34
2.3 ND5/6区域PCR扩增结果的琼脂糖检测34
2.4 扩增产物酶切后电泳检测的结果34-37
2.6 遗传变异及系统发育联系37-38
3 讨论38-42
3.1 关于泥鳅倍性浅析38-39
3.2 关于多倍体泥鳅的地理分布39-40
3.3 二倍体与四倍体泥鳅的遗传变异和遗传联系40-42
第3章 二倍体泥鳅不同地理群体线粒体DNA ND-5/6基因多态性及遗传多样性的PCR-RFLP浅析42-55
1 材料与策略42-44
1.1 实验材料42-43
1.2 实验策略43-44
1.2.1 泥鳅倍性的流式细胞仪检测步骤43
1.2.2 DNA的提取43
1.2.3 DNA浓度的测定43
1.2.4 DNA质量的电泳检测43
1.2.5 PCR扩增43
1.2.6 限制性核酸内切酶单酶酶切和电泳43-44
1.2.7 数据处理和浅析44
2 结果与浅析44-50
2.1 DNA提取结果44-45
2.2 PCR扩增结果检测45
2.3 扩增产物的酶切电泳检测45-48
2.4 多样性指数及聚类图48-50
3 讨论50-54
3.1 ND5/6基因在群体遗传学中的运用50-51
3.2 泥鳅群体的遗传多样性浅析51-52
3.3 长江流域泥鳅的资源保育52-54
小结54-55
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