斑蝥乳糖化去甲斑蝥素N三壳聚糖纳米粒查抄袭率-turnitin论文查重

摘要：目的合成中性条件下有良好溶解特性的N-三壳聚糖（N-trimethylchitosan, TMC），并以其为载体，以具有主动肝靶向的乳糖化去甲斑蝥素为模型药物，制备乳糖化去甲斑蝥素三壳聚糖纳米粒（Lactosyl-norcantharidin-associated N-trimethyl chitosan nanoparticles，Lac-NCTD-TMC-NPs）,以纳米粒的被动靶向和Lac-NCTD的主动靶向两个方面，达到药物在体内的双重肝靶向识别，增加Lac-NCTD的抗肝癌疗效。策略(1)通过烷基化反应，在壳聚糖的自由氨基上连接上三个，得到N-三壳聚糖。经红外光谱、~1HNMR表征确证N-三壳聚糖的结构，并通过特性黏度测定三壳聚糖的分子量。以N-三壳聚糖为载体，采取离子交联法制备乳糖化去甲斑蝥素三壳聚糖纳米粒，通过单因素和正交设计等策略优化纳米粒的处方工艺。利用红外光谱等技术对纳米粒进行表征，并考察不同介质中纳米粒胶体的释放特性。(2)以Caco-2细胞为模型，评价Lac-NCTD及其纳米粒的吸收情况。考察了时间、温度、浓度、外排作用对药物摄取的影响；考察了给药浓度、P-gp抑制剂、MRP2抑制剂、内吞抑制剂和细胞旁路转运推动剂对药物细胞转运的影响。（3）以人源性肝肿瘤细胞株HepG2为体外肿瘤模型，采取MTT法探讨纳米粒的细胞毒性，同时采取流式细胞术探讨药物的作用机制。定量定性地考察纳米粒对肝肿瘤细胞的亲和性。（4）以H22荷瘤小鼠为肿瘤模型动物，Cy7标记纳米粒，采取小动物活体成像技术考察纳米粒在小鼠体内的吸收分布情况。(5)以H22荷瘤小鼠为肿瘤模型动物，考察纳米粒在小鼠体内的抗肿瘤活性，并对乳糖化去甲斑蝥素及两种纳米粒的安全性进行初步评价。结果(1)合成了不同季铵化程度的三壳聚糖，其结构得到红外图谱和~1HNMR谱的表征；利用乌氏黏度测得三壳聚糖的特性黏度及分子量比壳聚糖原料有所降低，它们的分子量分别为：CS：8.4kDa; TMC:6.8kDa。分子量的降低可能是壳聚糖在季铵化反应中分子发生断裂。通过单因素实验，正交实验优化Lac-NCTD-TMC-NPs制备处方。纳米粒特性表征结果:平均粒径(120.6±1.7)nm，PDI为0.167，包封率(69.29±0.76)%，载药量(9.1±0.07)%。透射电镜照片显示纳米粒外观圆整，粒径分布均匀。纳米粒胶体释放行为均体现出显著的缓释特性，释放行为符合Higuchi方程。(2)Caco-2细胞评价吸收实验表明：Lac-NCTD以主动转运为主，旁路转运为辅的方式被细胞摄取转运的。P-gp，MRP2抑制剂CyA和MK-571能显著推动药物的细胞摄取。纳米粒的吸收情况显著优于原料药。（3）纳米粒外对肝肿瘤细胞HepG2更具亲和性，细胞毒作用更显著，Lac-NCTD是通过诱导细胞凋亡途径致细胞死亡的。（4）小动物活体成像实验显示了两种纳米粒较好的肝脏和肿瘤靶向性。(5)纳米粒可有效增加Lac-NCTD的抗肿瘤作用,三壳聚糖纳米粒相对于壳聚糖纳米粒，有更好的抗肿瘤效果。NCTD经乳糖修饰后肾毒性显著降低。纳米粒治疗组小鼠的心、肝、脾、肺、肾与生理盐水组相比均未见异常，乳糖化去甲斑蝥素及两种纳米粒在治疗浓度内是安全的。结论优化的乳糖化去甲斑蝥素三壳聚糖纳米粒工艺简单、成本低廉、稳定性较好。三壳聚糖纳米粒具有缓释药物和体内双重肝靶向作用，可显著提升药物的抗肿瘤作用。结果提示，Lac-NCTD-TMC-NPs是一种具有良好开发潜力的新型靶向抗肿瘤递药系统。关键词：乳糖化去甲斑蝥素论文三壳聚糖论文肝靶向论文纳米粒论文

中文提要4-6

Abstract6-12

引言12-21

第一章三壳聚糖的合成及纳米粒的制备21-34

材料21

策略与结果21-33

一、N-三壳聚糖的制备21-22

二、N-三壳聚糖的结构表征22-24

1. 红外(FT-IR)图谱22-23

2. 核磁共振(1HNMR)图谱23

3. 黏度和分子量计算23-24

三、纳米粒的制备24-30

1. 乳糖化去甲斑蝥素的含量测定24-25

1.1 Hplc 色谱条件24

1.2 标准曲线24

1.3 精密度24-25

1.4 回收率25

2. 制备策略25

3. 质量评价25-26

3.1 粒径分布和多分散指数25

3.2 包封率25

3.3 载药量25-26

4. 纳米粒的制备处方优化26-28

5. 优化的纳米粒制备工艺28-30

5.1 纳米粒粒径28

5.2 红外表征28-29

5.3 透射电镜表征29-30

四、N-三壳聚糖纳米粒的体外释放特性30-33

讨论与小结33-34

第二章乳糖化去甲斑蝥素及纳米粒的吸收机制探讨34-55

材料34-35

策略与结果35-53

一、Caco-2 细胞模型的建立和验证35-38

1. 细胞培养条件35

2. 细胞模型的验证35-38

2.1 细胞形态和酶表达情况35-36

2.2 TEER(跨膜电阻值)测定36-37

2.3 电镜观察细胞单分子层形态与结构37

2.4 酚红转运37-38

二、乳糖化去甲斑蝥素及纳米粒在 Caco-2 细胞模型中的摄取38-47

1. 乳糖化去甲斑蝥素细胞样品的高效液相色谱浅析策略的建立38-40

1.1 HPLC 色谱条件38-39

1.2 线性范围39

1.3 回收率和精密度39-40

2. MTT 实验40-41

3. 摄取实验41-47

3.1 时间对摄取的影响41-42

3.2 浓度对摄取的影响42-43

3.3 介质 pH 值对摄取的影响43

3.4 温度对摄取的影响43-44

3.5 外排抑制剂对摄取的影响44-45

3.6 纳米粒的细胞摄取实验45-46

3.7 FITC 标记纳米粒的制备及摄取实验46-47

三、乳糖化去甲斑蝥素及纳米粒在 Caco-2 细胞模型中的双向转运47-53

1. 转运实验中乳糖化去甲斑蝥素高效液相色谱浅析策略的建立47-48

1.1 HPLC 色谱条件47

1.2 线性范围47-48

1.3 回收率和精密度48

2. 转运实验48-53

2.1 浓度对转运的影响48-49

2.2 外排作用对药物转运的影响49-50

2.3 细胞内吞和旁路转运对药物转运的影响50-51

2.4 纳米粒的转运实验案例51-53

讨论与小结53-55

第三章纳米粒的体外药效学和靶向性评价55-69

材料55-56

策略与结果56-68

一、对肝肿瘤细胞的毒性56-58

二、凋亡检测58-61

1. Hochest33258 染色58-59

2. 流式细胞术检测细胞凋亡（Annexin V- FITC/ PI 双染色法）59-61

三、肝肿瘤细胞的摄入61-68

1. HPLC 法定量浅析61-63

1.1 色谱条件61

1.2 线性范围61

1.3 回收率和精密度61-62

1.4 HepG2 细胞对 Lac-NCTD 及其纳米粒的摄入62-63

2. 激光共聚焦显微镜观察 FITC 标记纳米粒在细胞内的摄入与分布63-65

3. 原子力显微镜观察纳米粒的细胞摄入历程65-68

讨论与小结68-69

第四章近红外小动物活体成像69-73

材料69-70

策略与结果70-72

一、荷瘤裸鼠模型建立70

二、Cy7 标记纳米粒的制备70-71

1. Cy7 标记 CS 和 TMC 的制备70

2. Cy7 标记的 Lac-NCTD-CS-NPs 和 Lac-NCTD-TMC-NPs 的制备70-71

三、Cy7 标记的纳米粒在裸鼠体内的近红外荧光成像71-72

讨论与小结72-73

第五章纳米粒的体内药效学评价73-80

材料73-74

策略与结果74-79

一、荷瘤小鼠模型建立74

二、纳米粒在荷瘤小鼠体内的抗肿瘤活性74-79

1. 抑瘤率74-75

2. 小鼠肿瘤的病理组织学观察75-77

3. 小鼠各脏器的组织学观察77-79

讨论与小结79-80

全文总结80-83

斑蝥乳糖化去甲斑蝥素N三壳聚糖纳米粒查抄袭率

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