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摘要：肿瘤化学治疗已有40多年历史，临床探讨中涌现出了500多种抗肿瘤药物，但由于肿瘤细胞多药耐药（MDR）以及抗肿瘤药物毒副作用大等因素的影响，目前肿瘤的死亡率仍然居高不下。据世界卫生组织（WHO）最新统计数据显示，2008年全球范围内约有760万人死于肿瘤，并预计到2030年这一数据将增加至1200万。纳米技术的进展尤其是基于纳米载药系统的靶向输送、非病毒载体基因治疗、诊断与治疗一体化等为肿瘤治疗开辟了一条新途径，并出现了纳米肿瘤学（Nano-oncology）这一新兴学科。本论文分为两部分，首先以纳米载药系统逆转肿瘤细胞MDR的角度，揭示聚乙二醇-聚乳酸（PEG-b-PLA）聚合物胶束细胞摄取途径及逆转肿瘤细胞MDR机制；其次针对光动力学治疗（PDT）中光敏剂的毒副作用，进展一种基于多孔硅的新型光敏剂。据美国癌症协会数据统计显示，90％以上的肿瘤患者死因与肿瘤细胞MDR相关，由此如何克服肿瘤细胞MDR是目前肿瘤临床治疗急需解决的不足。近年来，纳米载药系统作为一种新型的逆转肿瘤细胞MDR对策，已显示出了良好的前景。聚合物胶束作为一种药物载体，在体内显示良好的稳定性和生物相容性，具有对难溶性药物增溶能力，并能通过增强渗透滞留（EPR）效应实现肿瘤的被动靶向。目前，已有多种Pluronic类的聚合物胶束系统作为逆转肿瘤细胞MDR制剂进入临床探讨。本论文以PEG-b-PLA聚合物胶束为探讨对象，探讨其细胞摄取途径及逆转肿瘤细胞MDR机制，为设计更加有效的纳米载药系统提供依据。光动力学治疗由于其低的创伤性及可局部治疗等优点在临床上被用来治疗多种肿瘤。但目前临床上利用的光敏剂有着毒副作用大、肿瘤选择性差、体内滞留时间长等缺点，即患者在利用后需要4－12周的避光时间，否则容易引起皮肤和眼睛光毒性。已有探讨发现多孔硅在可见光的照射下能产生单线态氧（~1O_2）。本论文首次将多孔硅纳米粒用作光敏剂杀伤肿瘤细胞，由于多孔硅具有低的暗毒性，良好的生物可降解性及生物相容性，有望代替目前临床上利用的小分子光敏剂而成为新一代低毒、生物可降解的纳米光敏剂。本论文在第二章中以PEG-b-PLA聚合物为探讨对象，制备、表征了载尼罗红和载紫杉醇的聚合物胶束，探讨了载紫杉醇聚合物胶束的体外释药行为及对人卵巢癌细胞A2780的杀伤作用，并证实了载尼罗红聚合物胶束能有效的被细胞摄取。在第三章中采取原子力显微镜，荧光共振能量转移（FRET）效应，全内反射荧光显微镜及各种特异性内吞抑制剂探讨了载尼罗红聚合物胶束细胞摄取机理，评价了载紫杉醇PEG-b-PLA聚合物胶束系统逆转肿瘤细胞MDR的作用，并探讨了其细胞摄取机理与逆转肿瘤细胞MDR两者之间的联系。本论文在第四章中采取电化学腐蚀策略通过制约电流制备了不同孔径及粒径的多孔硅纳米粒，分别评价了其在乙醇溶液和水溶液中的~1O_2量子产率。在此基础上，第五章探讨了多孔硅纳米粒作为光敏剂分别在钨卤素灯和LED灯光源下对人宫颈癌HeLa细胞和小鼠胚胎成纤维NIH3T3细胞的杀伤作用。主要探讨结果如下：(1)采取成膜法分别制备了载紫杉醇和载尼罗红的PEG-b-PLA聚合物胶束。透射电镜结果显示两者均呈球形，单分散均匀分布，且具有核－壳结构。动态光散射测定载尼罗红胶束的平均水化粒径为104.1nm，PDI为0.24，载紫杉醇胶束的平均水化粒径为61.0nm，PDI为0.13。 PEG-b-PLA聚合物胶束对紫杉醇的包封率为64.7%，载药量为6.08％。体外药物释放结果显示聚合物胶束包裹的紫杉醇比游离紫杉醇释放更缓慢，24h后游离紫杉醇100％完全释放，约80％以载紫杉醇PEG-b-PLA聚合物胶束中释放。在人卵巢癌A2780细胞株上的体外毒性实验结果显示紫杉醇经PEG-b-PLA聚合物胶束包裹后，仍然具有与游离紫杉醇同样的细胞杀伤能力。激光共聚焦显微镜结果显示载尼罗红PEG-b-PLA聚合物胶束能有效的被人卵巢癌A2780细胞、大鼠C6胶质瘤细胞和人晶状体上皮HLE细胞摄取，红色荧光主要分布在细胞膜和细胞质内，4％多聚甲醛固定能增强细胞膜通透性，并使细胞膜上红色荧光消失。(2)载尼罗红PEG-b-PLA聚合物胶束与人卵巢癌A2780细胞作用不同时间点后，激光共聚焦显微镜显示细胞膜上具有很强的红色荧光。原子力显微镜50!50μm细胞整体形态三维观察结果表明经PEG-b-PLA空白胶束或载尼罗红聚合物胶束处理后细胞表面粗糙，400!400nm局部放大后观察到细胞表面具有一些小的簇状物质，提示两亲性嵌段聚合物可能插入到两亲性的细胞膜上。接下来构建了以DAF为供体，尼罗红为受体的FRET对，激光共聚焦显微镜结果表明位于聚合物胶束疏水性内核中的尼罗红与细胞膜上标记的DAF之间发生了FRET效应，证实了PEG-b-PLA聚合物胶束能快速有效的将其携载的尼罗红分子释放到细胞膜上，而不是通常认为的携带药物分子一起进入细胞。全内反射荧光显微镜在观察载尼罗红聚合物胶束细胞摄取历程中，追踪到了细胞膜附近100nm以内红色荧光囊泡的出现、转运及消失，说明释放到细胞膜上的尼罗红分子被细胞摄取的历程也涉及到内吞途径。经过各种针对不同内吞途径的特异性抑制剂处理后，激光共聚焦显微镜定性及流式细胞仪定量检测结果一致显示该历程是一个需要消耗ATP的脂筏/膜窖蛋白依赖的内吞历程。值得指出的是，在人卵巢癌对紫杉醇耐药株A2780/T细胞上的毒性结果显示，载紫杉醇聚合物胶束比游离紫杉醇具有更高的杀伤肿瘤耐药细胞的效果，具有逆转肿瘤细胞MDR的作用。在对PEG-b-PLA聚合物胶束逆转肿瘤细胞MDR机理的进一步探讨中揭示了PEG-b-PLA聚合物胶束是通过与细胞膜相互作用，增强细胞膜微黏度，使细胞膜去极化，以而降低细胞膜上Pgp ATP酶的活性而抑制Pgp外排功能，使耐药株细胞内的紫杉醇有效浓度更高，以而达到逆转肿瘤细胞MDR的作用。该探讨对探讨纳米载药系统逆转肿瘤细胞MDR机制及设计更加有效的纳米载药系统提供了新的思路。(3)采取电化学腐蚀策略制备了多孔硅纳米粒。并通过制约腐蚀电流，制备了粒径在100-200nm，孔径在7.9-17.6nm的多孔硅纳米粒。扫描电镜显示多孔硅纳米粒表面多孔结构规则，且孔径随着电流强度的增加而增加。傅立叶-红外光谱结果表明新制备的多孔硅纳米粒表面主要为Si-H键，同时因部分氧化使其表面形成少量Si-O键，增加了多孔硅纳米粒的亲水性。以1,3-二异苯并呋喃（DPBF）为乙醇溶液中的~1O_2捕捉剂，玫瑰红（Rose Bengal）为标准物质，测定结果显示不同孔径多孔硅纳米粒于乙醇溶液中的~1O_2量子产率在5％-12％之间。受溶剂淬灭、多孔硅纳米粒表面氧化、超声历程中多孔硅孔隙率转变等多种因素的影响，多孔硅孔径和~1O_2量子产率之间并没有显著的依赖联系。与此类似，以SOSG (singlet oxygen greensensor)为水溶液中的~1O_2捕捉剂，计算了200mA/cm2腐蚀电流下制备的多孔硅纳米粒在水溶液中~1O_2量子产率为0.17±0.01，与采取9,10-蒽基-双(亚)二丙二酸（AMDA）为水溶液中的~1O_2捕捉剂检测得到的结果0.15±0.02基本一致。(4)分别以钨卤素灯和LED灯作为光源，探讨了多孔硅纳米粒对HeLa细胞和NIH-3T3细胞的光毒性，表明了多孔硅纳米粒在光照条件下能杀伤肿瘤细胞，且细胞光毒性随着光照强度和多孔硅纳米粒浓度的增加而增加。HeLa细胞形态观察结果显示光对照组（不含纳米粒）和纳米粒对照组（不含光照）的细胞形态与未经过处理的对照组（既不含纳米粒也无光照）无显著差别，而实验组（多孔硅纳米粒＋光照）中HeLa细胞缩起变圆，失去粘附能力。细胞毒性结果表明若将含多孔硅纳米粒的培养基在光照后继续与细胞孵育24h，细胞杀伤作用比光照后立即换新的细胞培养基条件下更强，这是由于~1O_2与细胞培养基中氨基酸、蛋白质等作用后产生了长期毒性物质，能进一步提升杀伤肿瘤细胞的能力。尽管如此，但由于受多孔硅纳米粒~1O_2量子产率偏低，体外降解速率过快及表面易氧化等因素的影响，同样质量浓度的多孔硅纳米粒细胞光毒性仍显著低于有机小分子光敏剂亚蓝。由此，如何通过多孔硅表面化学修饰，提升其~1O_2量子产率，优化多孔硅降解速率，使其具有较短的体内滞留时间同时又不因降解速率过快而影响其产生~1O_2的能力尚有待进一步探讨。此外，本论文中还证明了多孔硅纳米粒不仅具有光敏特性，在较高浓度和较强的光照条件下，还具有光辐射热特性。本探讨中发现6mg/mL多孔硅纳米粒在100mW/cm2钨卤素灯照射下，10min内多孔硅的热辐射效应致温度升高23°C，若将光照强度升至300mW/cm2，热辐射效应致温度升高36°C。但值得指出的是，在本课题细胞光毒性探讨中所利用的最高纳米粒浓度和最高光照强度下，多孔硅的热辐射效应均小于1°C，其影响可忽略不计，即本课题中所观察到的细胞毒性是由多孔硅纳米粒光化学反应产生~1O_2而引起的。该探讨为开发新一代低毒，生物可降解的多孔硅纳米光敏剂提供了基础。总体来看，纳米载药系统在克服肿瘤细胞MDR及降低抗肿瘤药物毒副作用方面已显示了巨大的潜力。随着纳米肿瘤学的进一步进展以及纳米载药系统与细胞相互作用机理的进一步揭示，未来纳米载药系统将向多功能、靶向、诊断与治疗一体化等方向进展，将会有更多的高效、低毒的纳米药物上市，使临床上对肿瘤化疗产生耐药及饱受化疗毒副作用摧残的的患者存活质量得到改善。甚至是根据肿瘤病人的表型特点设计纳米药物载体，实现肿瘤个性化治疗。关键词：肿瘤细胞论文聚合物胶束论文细胞摄取论文多药耐药性论文紫杉醇论文p-糖蛋白论文多孔硅纳米粒论文光动力学治疗论文光敏剂论文单线态氧论文
摘要4-9
Abstract9-18
1 绪论18-43
1.1 聚合物胶束纳米载药系统19-29
1.2 多孔硅29-35
1.3 光动力学治疗35-41
1.4 本论文的探讨目的及内容41-43
2 PEG-b-PLA 聚合物胶束的制备、表征、体外细胞毒性及细胞摄取探讨43-54
2.1 仪器与试剂43-44
2.2 实验策略44-46
2.3 结果与讨论46-53
2.4 本章小结53-54
3 PEG-b-PLA 聚合物胶束细胞摄取机制及逆转肿瘤多药耐药性的探讨54-75
3.1 仪器与试剂55
3.2 实验策略55-58
3.3 结果与讨论58-73
3.4 本章小结73-75
4 多孔硅纳米粒的制备、表征及单线态氧量子产率探讨75-90
4.1 仪器与试剂75-76
4.2 实验策略76-79
4.3 结果与讨论79-88
4.4 本章小结88-90
5 多孔硅纳米粒的体外光毒性探讨90-102
5.1 仪器与试剂91-92
5.2 实验策略92-93
5.3 结果与讨论93-101
5.4 本章小结101-102
6 全文总结102-106
6.1 本论文的主要结果102-103
6.2 本论文的革新之处103-104
6.3 本论文有待改善之处104-105
6.4 展望105-106
致谢106-108