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摘要：目的和作用：近年来，诸多探讨表明免疫炎症反应参与冠心病的发病机制，而作为免疫炎症反应中最为重要的抗原提呈细胞-树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）在免疫反应中发挥着重要的作用。由于趋化因子受体CCR7在未成熟的树突状细胞（Immature dendritic cells，imDCs）表面低表达，而在成熟的树突状细胞表面高表达，推测CCR7可能与DCs的成熟有着密切的联系。另外在免疫反应的历程中imDC主要起着摄取抗原的作用，成熟的DCs将摄取抗原呈递给T淋巴细胞引起免疫炎症反应。CCR7能否调控DCs的成熟目前尚不清楚。本论文通过体外原代分离培养大鼠性树突状细胞（Rat Bone Marrow-derivedDendritic Cells，BMDCs），进一步通过形态学及其细胞表型进行鉴定。同时构建趋化因子受体CCR7的RNA干扰的慢病毒载体，进一步转染imDCs；转染6天后，通过RT-PCR和Western Blot分别检测CCR7mRNA和蛋白的表达以及ELISA法检测细胞培养上清液中巨噬细胞炎性蛋白1a(MIP-1a)和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的含量（由于相关探讨表明随着DCs的成熟培养上清液中MIP-1a分泌是逐渐降低的，MCP-1分泌是逐渐增高的）。探讨沉默CCR7基因后对DCs成熟的影响，以而通过抑制DCs的成熟为动脉粥样硬化性心脏病乃至于心血管疾病的治疗提供新的思路。策略:体外分离培养及其鉴定大鼠性树突状细胞：取出150-180g（雌雄不限）SD大鼠双下肢股骨和胫骨，用5ml注射器吸取含10%FCS的RPMI-1640培养基冲洗骨髓腔收集骨髓细胞，继而用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-C）5ng/ml和白细胞介素-4（Interleukin4，IL-4）5ng/ml诱导分化，培养至第6天收集悬浮细胞（即imDCs），继续用GM-C2.5-5ng/ml进行分化培养，一般至12天可获得成熟的树突状细胞。分别收集第6天、9天、12天及14天BMDCs，通过形态学及流式细胞仪检测细胞表型对BMDCs进行鉴定。由吉凯公司完成RNA干扰慢病毒载体构建和慢病毒包装与滴度的检测，获得4个靶点的shRNA，通过RT-PCR检测mRNA和Western Blot检测蛋白筛选最佳的靶点。本探讨分为3个组：实验组为转染CCR7-GFP-LV的DCs、阴性对照组为转染NC-GFP-LV的DCs，空白对照组为正常培养的DCs。用筛选出最佳的靶点CCR7-GFP-LV转染第6天的树突状细胞，稳定转染6天后通过RT-PCR和Western Blot检测各组CCR7mRNA和蛋白的表达水平，通过ELISA法检测三个组细胞培养上清液中MIP-1a和MCP-1的含量，通过MTT法检测CCR7沉默后对DCs生长增殖情况的影响。结果:体外培养初期（6-9天）树突状细胞呈半悬浮状态，圆形，无树突；培养至后期（12天左右）呈半悬浮半贴壁状态，圆形或椭圆形，部分细胞可见树突状突起。流式细胞表型的鉴定结果示培养初期低表达CD86，中度表达MHC-II，至培养后期CD86和MHC-II的表达均增高。ELISA检测结果示随着培养时间的延长MIP-1a含量逐渐降低，而MCP-1含量逐渐增高。由吉凯公司提供4个靶点，经过RT-PCR和Western Blot筛选出最佳靶点为CCR7-RNAi-LV3#,其浓缩病毒滴度为6×108TU/ml.转染CCR7shRNA慢病毒转染后6天（第12天DCs），70-75%左右的BMDCs表达GFP， RT-PCR结果显示CCR7mRNA表达情况实验组（26.85±0.03）%与空白对照组（93.01±0.01）%和阴性对照组（83.69±0.01）%相比P0.05，具有统计学作用；Westeern Blot结果示：CCR7蛋白表达情况实验组（47.86±0.02）%与空白对照组（93.50±0.05）%和阴性对照组（91.35±0.02）%相比P0.05，具有统计学作用；ELISA结果显示MIP-1a含量实验组（30.70±0.50）pg/ml与空白对照组（25.33±1.74）pg/ml和阴性对照组（26.95±0.22）pg/ml相比P0.05,具有统计学作用；MCP-1含量实验组（25.50±0.95）pg/ml与空白对照组（31.06±1.41）pg/ml和阴性对照组（31.44±1.95）pg/ml相比P0.05,具有统计学作用；MTT结果示：CCR7沉默后实验组与空白对照组和阴性对照组相比P0.05,具有统计学作用。结论: CCR7慢病毒载体构建成功，转染CCR7shRNA慢病毒载体后BMDCs的CCR7mRNA和蛋白表达水平显著下调，细胞培养上清液中MIP-1a含量显著增高和MCP-1含量显著下降，同时DCs的生长增殖情况受到显著的抑制；CCR7基因沉默后具有抑制DCs成熟的作用，可以为下一步诱导DCs对相关抗原（如氧化性低密度脂蛋白，ox-LDL）产生免疫耐受做好前期工作，可能为冠心病的治疗提供新的靶点。关键词：CCR7论文树突状细胞（DCs）论文慢病毒载体论文RNA干扰论文
摘要3-5
ABSTRACT5-9
中英文缩略词表9-10
第1章 引言10-12
第2章 材料与策略12-26
2.1 实验材料12-13
2.2 实验策略13-26
第3章 结果26-36
3.1 大鼠 BMDCs 生长特点及鉴定结果26-28
3.2 DCs 在培养历程中上清液中 MIP-1a 和 MCP-1 含量的变化情况28-29
3.3 病毒感染预实验的结果29-30
3.4 病毒感染正式实验的结果30-32
3.4.1 细胞转染的结果30
3.4.2 各组 CCR7 mRNA 表达情况的结果30-31
3.4.3 各组 CCR7 蛋白表达情况的结果31-32
3.5 CCR7 沉默后 DCs 表面的 CCR7 mRNA 表达情况32
3.6 CCR7 沉默后 DCs 表面的 CCR7 蛋白表达情况32-33
3.7 CCR7 沉默后上清液中 MIP-1a 和 MCP-1 含量变化情况33-34
3.8 CCR7 沉默后对 DCs 生长增殖情况的影响34-36
第4章 讨论36-41
第5章 结论及展望41-42
5.1 结论41
5.2 展望41-42
致谢42-43