摘要：目的：结核性脑膜炎（Tuberculous meningitis，TBM）是神经系统结核病中最常见的疾病，也是死亡率最高的肺外结核病。在中枢神经系统结核中，金属基质蛋白酶9（MMP-9）分泌增加，并发症和死亡与MMP-9含量有关。但目前对结核杆菌是如何引起中枢神经系统组织细胞的MMP-9过度表达分泌了解不多。本实验采取结核杆菌H37Rv感染人外周血单个核细胞后的条件培养基刺激人星型胶质瘤细胞系U251，了解结核性脑膜炎发病中脑组织主要细胞MMP-9的表达分泌特点，以及脑组织细胞在调控MMP-9分泌时的相互作用，以进一步了解结核性脑膜炎的发病机制。策略：六孔板按每孔1.0×10~6接种U251细胞，待细胞贴壁后，予结核分枝杆菌H37Rv按MOI（感染复数，即细菌：细胞比例）=1、10和100直接感染72h后(M.tb组)，收集细胞上清，Epsa法检测MMP-9含量，裂解细胞提取总RNA，RT-PCR检测MMP-9基因表达。密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞（PBMCs）后，用RPMI-1640培养基稀释，接种六孔板（1.0×10~6细胞/孔），予结核分枝杆菌H37Rv按10:1的感染复数感染细胞，37°C培养24h后，收集上清，0.2μm滤膜过滤除菌获得条件培养液，其中感染结核杆菌的单个核细胞培养液为CoMTB组（PBMC+1640+H37Rv），未感染结核杆菌的单个核细胞培养液为CoMCON组（PBMC+1640），在不含单个核细胞的1640中孵育结核杆菌的培养液为CoTB组（1640+H37Rv）。以上面陈述的条件培养液1:5稀释，加入到6或24孔板星型胶质瘤细胞系U251继续培养，ELISA检测刺激后12h、24h、48h和72h细胞上清的MMP-9含量变化，流式细胞因子试剂盒检测上面陈述的时间点细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12含量变化；收集共培养后72h的细胞，提取总RNA，定量RT-PCR检测MMP-9和上面陈述的炎性细胞因子mRNA表达情况；明胶酶谱法检测CoMTB组24h、48h、72h和72h CoMCON组、CoTB组MMP-9的活性；Western Blot检测CoMTB组12h、24h、48h、72h和72h CoMCON组、CoTB组MMP-9蛋白的表达；提取0，0.5h，1h，2h和6h CoMCON组和CoMTB组刺激U251细胞后的胞核蛋白，Western Blot检测NF-κB p65蛋白的表达水平。结果：①用结核杆菌按MOI=1、10和100的比例感染U251细胞72h后，Epsa法和RT-PCR均未检测到MMP-9分泌和表达。②ELISA结果显示CoMTB组MMP-9显著升高，12h开始升高(400.1±12.6pg/ml)，24h显著升高(1750.5±120.9pg/ml)，此后持续生升高至72h(2900.3±108.4pg/ml)，刺激时间越长，浓度越高，而72h CoMCON组和CoTB组MMP-9浓度分别为（70.6±10.4pg/ml、135.6±12.8pg/ml），差别有显著统计学作用(P0.01)。③TNF-α、IL-1β在CoMCON组未检测到，在CoTB组含量较低（72h分别为114.0±11.7pg/ml、1459.2±221.g/ml），CoMTB组升高最显著(72h分别为330.8±35.7pg/ml、3165.4±453.2pg/ml)，差别有显著统计学作用(P0.01)，IL-6、IL-8、 IL-12在三组上清中均能检测到，但以CoMTB组升高最显著(72h分别为1789.6±278.4pg/ml、4311.7±565.4pg/ml、702.7±102.9pg/ml），差别有统计学作用（P0.05），IL-10三组均未见升高（均3.0pg/ml），无统计学差别。④RT-PCR检测MMP-9发现仅在CoMTB组表达，CoMCON、CoTB二组均未表达，在CoMCON组中，TNF-a、IL-1β未表达，在CoTB组中低表达（相对含量0.123±0.08、0.544±0.134），而在CoMTB组高表达（相对含量0.487±0.119、0.891±0.222），差别有显著统计学作用， IL-6、IL-8、 IL-12在三组中均表达，但以CoMTB组表达最多，差别有统计学作用，三组中利用IL-10引物均不能通过PCR策略检出条带，提示可能IL-10的含量很少。⑤明胶酶谱法结果显示CoMTB组24h、48h和72h上清均可见一大小为92KDa的空白透亮条带，与染成蓝色的明胶背景比较，且随刺激时间延长， MMP-9活性增加，而72h CoMCON和COTB组未见条带。⑥Western-Blot可检测到CoMTB组24h、48h、72h细胞上清中MMP-9蛋白表达，而CoMCON和CoTB组未检测到。⑦Western-Blot检测核蛋白NF-κB p65水平，结果显示CoMTB组刺激30min后，星型胶质细胞NF-κB p65表达开始增加，与CoMCON组相比,1h后增加2倍（P0.05），2h时增加5倍（P0.01），并持续升高至6h。结论：结核杆菌直接刺激人星型胶质瘤系U251细胞不能引起MMP-9的分泌和基因表达；而结核杆菌感染外周血单个核细胞后的条件培养基（CoMTB组）刺激U251细胞后能分泌MMP-9，且刺激时间越长，含量越高；不含单个核细胞的结核杆菌条件培养基（CoTB组）和未感染结核杆菌的单个核细胞条件培养基（CoMCON组）刺激星型胶质细胞也不会引起MMP-9分泌；CoMTB组显著引起炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12的升高，而抑炎因子IL-10并不升高，并能增加胞核蛋白NF-κB p65的表达，说明CoMTB组条件培养基可引起炎性细胞因子分泌增加，增加的炎性细胞因子可能通过激活NF-κB信号通路上调MMP-9基因的表达和分泌，提示单核细胞依赖的细胞因子网络在中枢神经系统结核基质降解中起重要作用。关键词：结核分枝杆菌论文U251细胞论文外周血单个核细胞论文金属基质蛋白酶9论文结核性脑膜炎论文
摘要3-6
ABSTRACT6-11
中英文对照表11-12
第1章 引言12-14
第2章 材料与策略14-28
2.1 材料、主要试剂及仪器14-17
2.1.1 材料14
2.1.2 主要试剂14-15
2.1.3 主要仪器15-16
2.1.4 引物序列16-17
2.2 实验策略17-27
2.2.1 主要溶液的配制17-19
2.2.2 人淋巴细胞分离管分离分离外周血单个核细胞（PBMCs）19-20
2.2.3 结核杆菌 H37Rv 培养20
2.2.4 结核杆菌 H37Rv 刺激人单个核细胞获得条件培养基20
2.2.5 人神经胶质瘤细胞系 U251 培养20-21
2.2.6 实验分组21-22
2.2.7 ELISA 法检测细胞培养液上清中 MMP-9 含量22
2.2.8 流式细胞术检测细胞培养液上清中 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12 的含量22-23
2.2.9 明胶酶谱法检测细胞上清中 MMP-9 的活性23
2.2.10 RT-PCR 检测条件培养基刺激 U251 细胞 72h 后 MMP-9、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12 mRNA 的表达23-24
2.2.11 Western blot 技术检测细胞上清中 MMP-9 蛋白、胞浆内参β-Actin 蛋白和胞核 NF-κB 蛋白表达水平24-27
2.3 统计学处理27-28
第3章 结果28-36
3.1 人神经星型胶质瘤细胞系 U251 细胞培养28
3.2 Epsa 法检测细胞上清液中 MMP-9 的含量28-29
3.3 RT-PCR 检测 MMP-9 在细胞中的表达29-31
3.4 流式细胞术检测细胞上清液中 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12 的表达31-32
3.5 RT-PCR 检测炎性细胞因子表达32-33
3.6 明胶酶谱法检测细胞上清中 MMP-9 活性33-34
3.7 Western Blot 检测条件培养基刺激后 MMP-9 蛋白的表达水平34-35
3.8 Western Blot 检测胞核蛋白 NF- 表达水平35-36
第4章 讨论36-40
第5章 结论40-41
致谢41-42
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