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摘要：探讨背景卵巢癌是妇科肿瘤首位致死性疾病,晚期(Ⅲ期或Ⅳ期)患者的5年存活率始终徘徊在20%-30%。在理想的肿瘤细胞减灭术的基础上辅助铂类药物为主的联合化疗是临床规范化的治疗手段。然而,化疗的原发或者继发性耐药的产生,肿瘤的复发和转移仍是卵巢癌治疗中的主要障碍,也是晚期患者五年存活率较低的主要理由。深入认识肿瘤发生、转移、以及耐药性产生的根本理由是改善预后的关键。现有探讨显示,肿瘤干细胞在疾病的发生、复发、以及转移中发挥着十分重要的作用,肿瘤化疗的失败可能与肿瘤干细胞的耐药性密切相关。肿瘤干细胞除有自我更新、高致瘤性和分化潜能外,因其细胞膜表面高表达ATP-binding cassette (ABC) transporters家族膜蛋白,这类蛋白可运输并外排包括代谢产物、药物、内源性酯类、多肽等多种物质,使许多杀伤肿瘤的药物作用显著减弱。由此开展对卵巢癌干细胞的探讨对于提升临床耐药的卵巢癌患者的5年存活率具有重要作用。对于特异性表面标记物的筛选鉴定是开展肿瘤干细胞探讨的关键环节之一分离肿瘤干细胞的常规策略是首先筛选出可能的肿瘤干细胞表面标记抗原,通过荧光激活细胞分选法(fluorescence activated cell sorting, FACS)和磁激活细胞分选(magneticactivated cell sorting, MACS)等策略分选出具有该标记的细胞,再进一步进行干细胞活性检测以及细胞移植、克隆形成、细胞增殖以及细胞分化等检验,浅析所筛选出的细胞是否具有肿瘤干细胞潜能。然而,迄今为止仍未发现卵巢癌干细胞有着着明确的特异性表面标志物。本探讨旨在寻找可能的卵巢癌干细胞特异性表面分子标志物,并验证其阳性的细胞亚群是否具有肿瘤干细胞潜能。运用SP细胞分选的策略,以两株卵巢癌细胞系中分选出富含干细胞的SP细胞亚群,采取稳定同位素标记和以质谱为基础的定量蛋白质组学技术对SP和非SP细胞的膜蛋白进行比较蛋白质组学浅析,筛选可能的卵巢癌干细胞特异性标记物的候选蛋白,进一步对候选蛋白阳性细胞进行肿瘤干细胞特性的验证。探讨策略1、运用Moflo荧光激活细胞流式分选仪分选出卵巢上皮癌细胞系OV3、 A2780中SP细胞亚群,并进行细胞系SP细胞募集,使得细胞系中SP细胞比例稳定在5%以上,可体外传代,可冻存。采取细胞培养条件下同位素稳定标记(stable isotope labepng with amino acids in cell culture, SLIAC)法分别以轻型、重型赖氨酸对富含干细胞的A2780、SKOV3田胞SP细胞亚群的进行稳定培养同位素标记,流式分选并收集足够数量的重型赖氨酸标记的SP细胞及轻型赖氨酸标记的NSP细胞。采取梯度离心法特异性以少量细胞中分离细胞膜成分,分别提取SP、NSP细胞膜蛋白,并将等量的SP细胞膜蛋白和NSP细胞膜蛋白充分混合,分离酶解肽段,质谱检测并定量蛋白质组学浅析,获得A2780、SKOV3共表达差别膜表面蛋白。根据差别表达水平及文献检索相关蛋白质功能,筛选差别表达候选膜蛋白,作为后续探讨目标蛋白。2、运用免疫印迹技术鉴定差别表达候选蛋白,筛选CDC50A作为卵巢癌干细胞特异性表面标志蛋白候选蛋白。细胞免疫荧光联合激光共聚焦技术观察细胞内的CDC50A在细胞内的定位,同时半定量浅析CDC50A在SP和NSP细胞亚群内表达水平。特异性荧光抗体标记卵巢上皮癌细胞系SKOV3和A2780,利用Moflo荧光激活细胞流式分选仪分选出候选蛋白阳性和阴性细胞亚群,并体外培养,富集各亚群细胞。3、采取流式细胞仪筛选候选蛋白阳性及阴性细胞亚群,验证其在DMEM (HG)培养基体外培养后再次分化成其他亚群的能力；MTT法验证候选蛋白阳性、阴性细胞亚群对紫杉醇和顺铂耐药性差别；同时采取此法测定每种细胞系候选蛋白阳性、阴性细胞亚群的细胞生长曲线；运用BD荧光激活流式细胞浅析仪浅析SKOV3细胞系中各亚群细胞周期,观察各细胞周期所占的比例,来检测其增生活跃情况。收集卵巢上皮癌细胞系候选蛋白阳性、阴性亚群细胞,通过单细胞接种96孔板,培养观察其单细胞克隆形成率,比较不同亚群的单细胞克隆形成能力；等量候选蛋白表达阳性、阴性细胞接种于NOD/SCID小鼠皮下,每组三只,观察成瘤速度,观察终止点为两组成瘤率或成瘤大小出现显著统计学差别；此外,运用RT-PCR技术,验证候选蛋白阳性细胞中其他几种主要干细胞相关基因(Oct-4、p-catenin、ABCG2)的表达情况。探讨结果1、成功分选并募集卵巢癌A2780、SKOV3细胞系SP细胞,SP细胞亚群比例稳定在6%-15%。成功运用细胞稳定培养同位素标记技术完成SP和NSP细胞蛋白赖氨酸标记。并有效地以106个细胞中提取出约12ug细胞膜蛋白,满足SLIAC蛋白质组学浅析所需蛋白质质量要求。运用SLIAC技术浅析出A2780SP. NSP细胞表达差别膜蛋白共2730种,其中成功测算表达差别的有1989种,表达差别在5.0以上的蛋白有着34种；SKOV3SP、NSP细胞表达差别膜蛋白共浅析2674种,成功测算表达差别的有1561种,其中表达上调蛋白920种。以SKOV3细胞株SP细胞表面差别表达膜蛋白为基准,同时参考A2780细胞株SP差别表达蛋白,通过对两个细胞系2000多种差别表达蛋白进行比较浅析,以在两种细胞株共同表达上调、细胞膜蛋白、以及H/L5为筛选标准,并结合文献检索相关蛋白质的功能,最终筛选出2种共表达差别膜蛋白CD59、CDC50A(又名TMEM30A)作为卵巢癌肿瘤干细胞表面标志物候选蛋白,进行后续探讨鉴定。2、运用特异性荧光抗体标记卵巢上皮癌细胞系SKOV3和A2780,细胞流式分选技术成功分选出候选蛋白CDC50A和CD59表达阳性和阴性细胞亚群,并体外培养,富集各亚群细胞。CDC50A阳性细胞经过三次分选募集,在卵巢癌细胞系中比例稳定1%以上。CD59阳性细胞比例第一次分选即为接近100%,论述上不符合干细胞低比例特性,所以放弃对于CD59作为卵巢癌干细胞标记蛋白的的进一步的探讨,后续单以CDC50A作为卵巢癌干细胞表面标志候选蛋白进行深入鉴定及浅析。运用免疫印迹技术证实在卵巢上皮癌细胞系SP亚群细胞中CDC50A的表达水平较NSP细胞显著上调。并通过细胞免疫荧光激光共聚焦技术观察并鉴定CDC50A在细胞细胞膜上的定位表达。3、肿瘤干细胞特性的验证的实验表明,流式分选出CDC50A+细胞亚群,体外培养出CDC50A-细胞,而CDC50A-细胞未能分化出CDC50A+细胞,表明CDC50A+细胞具有多向分化潜能。细胞生长曲线的结果显示,CDC50A+细胞生长速度显著快于CDC50A-细胞。MTT对细胞耐药性的检测发现,发现CDC50A+、 CDC50A-细胞在对紫杉醇和顺铂耐药方面有着显著差别,尤其是对顺铂的耐药性比较发现,CDC50A+细胞对顺铂的耐药指数显著高于CDC50A-细胞。细胞增殖周期检测结果提示CDC50A+细胞处于静止期的比例高于CDC50A-细胞。体外细胞克隆形成实验证实,SKOV3细胞系中CDC50A+细胞单克隆形成率为12.5%,而CDC50A-细胞单克隆形成率仅为4.86%,两者相比差别有着显著的统计学作用,P=0.01420.05；同样,A2780细胞系中CDC50A+细胞的单克隆形成率为18.75%,显著高于CDC50A-细胞5.56%的克隆形成率为5.56%,P=0.00750.05,差别具有显著统计学作用。体内动物实验进一步验证了CDC50A+细胞体内成瘤能力显著强于CDC50A-细胞,小量CDC50A+细胞组在NOD/SCID小鼠体内成瘤率100%,平均成瘤时间20天,而相同数量CDC50A-细胞组和SKOV3贴壁细胞组在观察结束时尚未发现成瘤。检测Oct-4、β-catenin、ABCG2三种干细胞相关基因的表达,除在A2780细胞株内β-catenin无显著变化外,两细胞株在CDC50A+细胞亚群中三种干细胞相关基因的表达均显著上调。结论1、体外培养卵巢癌细胞系内有着SP细胞亚群,比例偏低,经过不断的培养、分选可以达到SP细胞的募集,所分选出的卵巢癌细胞系SP亚群细胞具有干细胞特性,成功获得了后续干细胞探讨的基本对象。本探讨首次采取稳定同位素标记和以质谱为基础的定量蛋白质组学技术,通过细胞稳定培养,成功标记并浅析出SP细胞内表达及其微量的差别表达蛋白,成功地运蛋白质组学技术以12ug总膜蛋白中高通量的浅析并筛选出上千种差别表达蛋白,并综合浅析以中筛选CDC50A和CD59两种蛋白质作为干细胞表面特异性标记候选蛋白。2、体外培养卵巢癌细胞系内CDC50A阳性亚群细胞比例低于1%,CD59接近100%,以而确定CDC50A作为候选蛋白继续探讨。运用免疫印迹技术证实在卵巢上皮癌细胞系SP亚群细胞中CDC50A的表达水平较NSP细胞显著上调。免疫荧光激光共聚焦技术观察鉴定CDC50A在细胞细胞膜上的定位表达。3、体外和动物实验的结果表明,卵巢癌细胞系内CDC50A阳性亚群细胞具有自我更新、多向分化和无限增殖等潜能。与CDC50A-细胞相比,Oct-4、 β-catenin、ABCG2等肿瘤干细胞标志的表达显著增高。动物体内成瘤实验的结果显示,CDC50A+细胞具有更强的致瘤能力。CDC50A能否成为卵巢癌干细胞特异性表面标记物有待于人体实验的进一步证明。关键词：卵巢癌论文肿瘤干细胞论文CDC50A论文SILAC论文
目录3-4
缩略词4-6
中文摘要6-10
Abstract10-16
前言16-20
第一章 卵巢癌干细胞表面标志物的筛选20-48
材料与策略20-27
实验结果27-40
讨论40-44