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遗传H6亚型禽流感病毒病原学监测和快速检测策略站

收藏本文 2024-01-25 点赞:17526 浏览:72672 作者:网友投稿原创标记本站原创

摘要:H6亚型禽流感病毒(AIV)属于低致病性A型流感病毒,水禽和野鸟是H6亚型禽流感病毒的主要宿主。H6亚型禽流感病毒可以感染哺乳动物,如鼠和水貂,甚至还有报道称在健康的青年体内检测到了H6亚型AIV的抗体。低致病性AIV通过基因重排等为H5N1等高致病性禽流感病毒提供基因,以而可能引起流感的流行。以2009年至2011年活禽市场采集样品中分离H6亚型禽流感病毒。用血凝抑制试验初步筛选,PCR策略进行进一步的确认检测,对NA基因进行序列测定。结果表明,2009年到2011年间的样品分离到7株H6亚型禽流感病毒,分别为1株H6N1,两株H6N2,一株H6N5,两株H6N6,一株H6N8。对分离到的7株鸭源H6亚型禽流感病毒的八个基因片段进行序列测定。完成7株H6亚型AIV的全基因测序后,将序列鉴定结果与GENBANK上的序列进行比对浅析。结果表明,7株H6亚型AIV的八个基因片段均属于欧亚谱系,基因来源结构比较复杂。在HA1和HA2剪切位点,7株分离株的氨基酸序列为P-Q-I-E-T-R-G,仅含一个碱性氨基酸,都符合典型低致病性禽流感病毒特点序列。建立了检测H6亚型禽流感病毒(AIV)逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测策略,对反应条件和反应系统进行优化。结果表明该策略的特异性良好,对其他呼吸道病原体均无扩增反应。该策略灵敏度高,最低可检测到H6亚型AIV RNA为0.01pg,该策略无需特殊仪器,只需在水浴锅中进行,是一种适于基层的简便、灵敏、快速的H6亚型AIV检测策略。并且建立了H6亚型禽流感病毒(AIV) SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR检测策略。结果表明,该策略的最低检测限为1.07×101拷贝质粒DNA,比RT-PCR灵敏度高出1000倍。对其他呼吸道病原体无扩增;检测快速,以样本处理到报告结果仅需3.5h。比较对H6亚型AIV建立的四种快速检测策略RT-PCR、巢式RT-PCR、实时荧光定量PCR和RT-LAMP四种策略的灵敏性。结果表明:四种策略中,实时荧光定量PCR的敏感性最高,其次为RT-LAMP和巢式RT-PCR,普通PCR敏感性最低。基层检验时可以根据需要和条件选择适合的检测策略,多种快速检测策略结合可以更好地确定诊断。关键词:H6亚型论文AIV快速检测论文全基因测序论文遗传进化浅析论文

    摘要4-6

    ABSTRACT6-11

    前言11-12

    第一章 :文献综述12-21

    1 禽流感病毒的分子病原学探讨进展12-17

    1.1 禽流感的流行概况和危害12

    1.2 禽流感病毒的概况12-16

    1.3 禽流感病毒的生物学特性16-17

    1.4 水禽和候鸟在禽流感传播中的作用17

    2 禽流感病毒的快速诊断策略探讨进展17-20

    2.1 逆转录-聚合酶链式反应17-18

    2.2 逆转录-巢式聚合酶链式反应18-19

    2.3 逆转录-环介导等温核酸扩增技术19

    2.4 实时荧光定量RT-PCR19-20

    3 本课题的探讨作用20-21

    第二章 :H6型禽流感病毒的分离鉴定和生物学特性探讨21-30

    1 材料与策略21-26

    1.1 材料21

    1.2 策略21-26

    2 结果26-28

    2.1 病毒分离结果26

    2.3 RT-PCR检测结果26

    2.4 毒株NA亚型的测定结果26-27

    2.5 H6型AIV病原性监测情况27-28

    2.6 鸡胚半数感染量(EID_(50))的测定和鸡胚半数致死量(ELD_(50))的测定结果28

    2.7 致病性实验结果28

    3 讨论28-30

    第三章 :7株H6亚型禽流感病毒的全基因序列测定与序列浅析30-54

    1 材料和策略30-33

    1.1 材料30

    1.2 策略30-33

    2 结果33-52

    2.1 H6亚型AIV全基因RT-PCR扩增结果33

    2.2 7株毒株的个基因片段克隆和序列测定结果33

    2.3 7株H6亚型AIV全基因组序列浅析33-52

    3 讨论52-54

    第四章 :H6亚型禽流感病毒快速检测策略的建立54-68

    1. H6亚型禽流感病毒RT-LAMP快速检测策略的建立54-62

    1.1 材料与策略54-56

    1.2结果56-60

    1.3 讨论60-62

    2. H6亚型禽流感病毒SYBR Green Ⅰ实时定量荧光PCR策略的建立62-68

    2.1 材料与策略62-63

    2.2 结果63-67

    2.3 讨论67-68

    第五章 :H6亚型禽流感病毒四种核酸检测策略比较68-74

    1 材料与策略68-71

    1.1 毒株和主要仪器试剂68

    1.2 病毒RNA的提取68

    1.3 质粒与核酸的梯度稀释68

    1.4 核酸浓度测定68

    1.5 引物的合成68-70

    1.6 四种检测策略的最佳扩增条件70

    1.7 四种核酸扩增策略的检出限测定70

    1.8 临床样品的检测70-71

    2 结果71-73

    2.1 质粒标准品敏感性检测结果与病毒RNA敏感性检测结果71-72

    2.2 临床样品检测结果72-73

    3 讨论73-74

    结论74-75

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