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摘要：探讨背景和目的：肠粘膜屏障功能损伤伴随着炎症性肠病的整个历程,其解剖基础是紧密连接结构的破坏。Rho激酶(ROCK)可通过调控下游肌球蛋白轻链(MLC)的磷酸化状态对细胞骨架结构造成影响,以而在维持紧密连接结构中发挥着至关重要的作用。NF-κB作为ROCK的另一下游信号分子同时也是调控各种炎症因子分泌的重要转录因子之一,由此ROCK亦有可能通过激活NF-κB推动肠道的炎症反应。本探讨目的在于探讨Rho/ROCK在肠道炎症及肠粘膜屏障损伤历程中的作用及相应的作用机制。探讨策略：60只Balb/c小鼠随机分为3组：正常对照组(n=10)、模型组(n=30)及Y-27632(n=20)组。模型组及Y-27632组小鼠于第1天以TNBS乙醇溶液灌肠；Y-27632组于第1天至第7天分别腹腔注射1Omg/kg的Y-27632qd。对照组则予以相应剂量的生理盐水处理。各组小鼠均于第8天处死。通过观察小鼠一般情况、死亡率及肠道炎症的病理评分评价小鼠肠道炎症情况；透射电镜观察小鼠肠道粘膜的紧密连接形态；以荧光素标记法检测肠道粘膜通透性；免疫组化法及Realtime-PCR法分别测定紧密连接蛋白ZO-1、Occludin以及相应的mRNA表达。通过Western blot法测定ROCK1、ROCK2及其下游因子phospho-MYPT-1Thr696、phospho-MLC Ser19、IκBα、phospho-IκBa Ser32/36、NF-κB p65及NF-κBp65Ser536的表达。探讨结果：模型组小鼠出现显著肉眼血便,且死亡率显著高于另外两组。Y-27632组小鼠肠壁炎症及肠道通透性较模型组显著改善。各组小鼠透射电镜下肠粘膜紧密连接形态未见显著差别。模型组小鼠肠壁紧密连接蛋白ZO-1及Occludin表达下降,经Y-27632干预后Occludin表达升高而ZO-1无显著变化。Y-27632组ROCK1及ROCK2的表达均受到显著抑制。模型组小鼠肠壁P-MYPT-1Thr696变化不显著,而P-MLC Ser19显著增加,Y-27632组小鼠P-MYPT-1Thr696及P-MLC Ser19表达均显著受到抑制。模型组小鼠肠壁IκBα表达较正常组下降,且P-IκBαSer32/36表达显著减少,下游NF-κB p65表达较正常组增加,P-NF-κBp65Ser536表达显著增加；Y-27632干预组与模型组比较,IκBα表达总量增加且P-IκBαSer32/36表达亦显著增加,而下游NF-κBp65及P-NF-κBp65Ser536表达均受到显著抑制。结论：1.通过抑制ROCK可以缓解TNBS诱导的小鼠肠道炎症,并可改善肠粘膜通透性。2. ROCK通过推动下游MYPT-1及MLC的磷酸化,以而转变肠粘膜紧密连接功能,进而影响肠道粘膜屏障功能。3. ROCK激活后可推动IκB。的总量表达,并可通过推动IκB。Ser32/36磷酸化以而激活IκBα,其下游NF-κBp65表达总量亦增加,且NF-κBp65的激活与其Ser536的磷酸化相关。4. ROCK有可能通过激活NF-κB通路以而造成炎症因子的大量分泌,进而推动肠道炎症病变的进展。探讨背景和目的ROCK在哺乳动物中有着两种异构体——ROCK1及ROCK2。尽管二者在结构上有着高度相似性,仍有探讨显示其在功能上有着差别。本探讨目的在于筛选出ROCK1、ROCK2的有效干扰片段,浅析二者对下游MLC信号通路及NF-κB信号通路影响的差别,以而深入探讨ROCK在肠炎历程中的作用机制,找出影响肠粘膜屏障功能的关键ROCK异构体。探讨策略分别针对ROCK1及ROCK2设计干扰序列,选取慢病毒pGLV-H1-GFP+Puro(LV3)作为载体,将干扰序列克隆至LV3内,产生LV3-shROCK1及LV3-shROCK2,测序鉴定后与辅助包装载体共同转入293T细胞中进行病毒包装后侵染Caco-2细胞。于侵染后72h及96h分别以Realtime-PCR及Western blot法于检测ROCK1、ROCK2表达以验证干扰效率,以而筛选出有效干扰片段。将细胞分为正常对照组；NC组；TNF-α组；NC+TNF-a组；LV3-shROCKl组；LV3-shROCK2组；LV3-shROCK1-shROCK2组。分别以Realtime PCR及Western blot法检测ROCK1、ROCK2及紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的基因及蛋白表达；Western blot法检测NF-κBp65及phospho-NF-KB p65Ser536以了解NF-κB通路,检测phospho-MYPT-1Thr696及phospho-MLC Ser19以了解MLC通路。结果根据Realtime-PCR及Western blot结果筛选出ROCK1有效干扰片段ROCK1-homo-1197及ROCK1-homo-1479; ROCK2有效干扰片段ROCK2-homo-797及ROCK2-homo-3051。TNF-α刺激24h后,TNF-α组及NC+TNF-α表达ROCK1及ROCK2蛋白均较无TNF-a刺激组显著增加。ROCKs被干扰后,ROCK1及ROCK2蛋白均有不同程度下调。LV3-shROCK1及LV3-shROCK2组NF-κBp65表达被抑制程度接近；而当ROCK1及ROCK2被同时干扰时,NF-κBp65表达则受显著抑制。ROCK2被干扰后,phospho-NF-κBp65Ser536表达较其在ROCK1干扰时显著减少。TNF-α刺激可引起phospho-MYPT-1Thr696及phospho-MLCSer19表达增加。ROCK1被干扰后phospho-MYPT-1Thr696表达显著降低,但单纯ROCK2被干扰时其表达降低不显著。ROCKs被干扰后phospho-MLCSer19的表达亦被抑制,但抑制程度与所干扰的ROCK异构体种类无关。各组细胞紧密连接蛋白ZO-1及Occludin的表达无显著差别。结论1.紧密连接蛋白的表达量TNF-α刺激及ROCKs的干扰均无相关性。2. ROCK1及ROCK2对NF-κBp65激活作用类似,但在NF-κBp65Ser536的磷酸化历程中更多依赖于ROCK2的激活作用。3. ROCK1及ROCK2对MLC Ser19磷酸化作用类似,但MYPT-1Thr696的磷酸化主要受ROCK1调控。说明ROCK2对MLC Ser19可能主要为直接作用或间接通过MYPT-1Thr696之外的其他途径所致。关键词：Rho激酶论文肠粘膜屏障论文紧密连接论文肌球蛋白轻链论文核因子κB论文Rho激酶论文RNA干扰论文核因子κB论文肌球蛋白轻链论文紧密连接蛋白论文
中英文缩略词对照表4-5
第一部分 Rho激酶对TNBS肠炎小鼠肠道炎症反应及肠粘膜屏障的影响5-48
中文摘要5-7
Abstract7-10
前言10-12
材料与策略12-20
附：技术路线图120-21
结果21-40
讨论40-43
结论43-44