本站原创摘要8-9
Abstract9-10
第1章 绪论10-36
1.1 结构特异性内切酶110-12
1.2 FEN1探讨进展12-30
1.2.1 FEN1蛋白与DNA底物结合的晶体结构模型12-15
1.2.1.1 FEN1与3’分枝的结合12-13
1.2.1.2 FEN1与5’分枝的结合13-15
1.2.2 FEN1的基本特点与突变体探讨15-16
1.2.3 FEN1的蛋白互作与功能16-19
1.2.4 FEN1与PCNA相互作用的探讨19-20
1.2.5 FEN1的体内调节机制20-23
1.2.5.1 FEN1的亚细胞定位20-21
1.2.5.2 FEN1的翻译后修饰21-23
1.2.6 FEN1生化功能的探讨进展23-29
1.2.6.1 FEN1与冈崎片段成熟途径23-24
1.2.6.2 FEN1与碱基切除修复途径24-25
1.2.6.3 FEN1与核苷酸切除修复途径25-26
1.2.6.4 FEN1参与其它DNA代谢的途径26-29
1.2.7 E160D FEN1突变体的探讨29-30
1.3 肺癌30-32
1.4 苯并芘32-34
本论文的论述依据和探讨作用34-36
第2章 细胞周期进程中程序性的翻译后修饰调控FEN1的降解36-59
引言36-37
2.1 实验材料和策略37-41
2.1.1 抗体、蛋白质、质粒和细胞株等材料37
2.1.2 细胞培养和周期同步化37-38
2.1.3 FEN1体外的磷酸化和放射性~(32)P的标记38
2.1.4 体外SUMO化的反应38-39
2.1.5 体外的泛素化反应39
2.1.6 FEN1在G2/M期细胞裂解物中的降解实验39-40
2.1.7 免疫耗竭(Immuno-depletion)实验40
2.1.8 质谱与数据浅析40
2.1.9 染色体计数40-41
2.2 实验结果41-54
2.2.1 在G2/M期通过泛素-蛋白酶体途径降解FEN141-43
2.2.2 SUMO3修饰能介导FEN1的降解43-45
2.2.3 FEN1的SUMO3修饰依赖于FEN1的磷酸化45-47
2.2.4 UBE1/UBE2M/PRP19复合体使FEN1泛素化47-50
2.2.5 SUMO3修饰刺激FEN1的泛素化50-52
2.2.6 程序性PTM调节S-G2/M后期阶段FEN1的降解52
2.2.7 FEN1降解的缺陷将导致细胞周期的延迟及基因组不稳定52-54
2.3 本章小结54-59
第3章 FEN1-E160D突变小鼠在苯并芘诱导下的肺癌高风险性的探讨59-75
引言59-60
3.1 实验材料和策略60-66
3.1.1 材料和设备60
3.1.2 小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞的富集60-61
3.1.3 MEF细胞的消化和传代61
3.1.4 MEF细胞的冻存61-62
3.1.5 MEF细胞的解冻和复苏62
3.1.6 细胞处理62-63
3.1.7 细胞计数63
3.1.8 免疫荧光显微检测63
3.1.9 免疫印迹(Western-blotting)63-64
3.1.10 染色体涂片64
3.1.11 制备BPDE损伤的DNA及体外B[α]P损伤DNA的修复实验64-65
3.1.12 制备检测GEN活性的泡状底物65-66
3.2 实验结果66-72
3.2.1 E160D细胞对BPDE损伤的DNA修复能力有所削弱66-67
3.2.2 E160D突变造成FEN1对DNA泡状底物剪切能力降低67-69
3.2.3 B[α]P处理的E160D突变体中出现较高频率的DSBs69-70
3.2.4 E160D细胞在B[α]P诱导下出现更多的染色体畸变70-71
3.2.5 E160D比WT小鼠在B[α]P诱导下有更大的肺部肿瘤发病率71-72
3.3 本章小结72-75
第4章 FEN1点突变体表达载体的构建75-81
引言75-76
4.1 实验材料与策略76-78
4.1.1 构建材料76
4.1.2 点突变引物设计76-77
4.1.3 点突变PCR及产物转化77
4.1.4 点突变的鉴定77-78
4.2 实验结果78
4.2.1 点突变引物设计78
4.2.2 点突变鉴定78
4.3 讨论78-81
总结与展望81-87
FEN1突变体探讨结论81-83
B[α]P与肺癌的相关探讨83-84
展望84-87