试析斑马鱼心脏毒性评价模型建立与美托洛尔心脏毒性作用机制经典

摘要：药物以设计到上市的整个探讨阶段，毒性反应是导致药物研发失败的最主要理由。即使上市后仍有许多药物由于出现研发阶段未能发现的毒性反应而被撤市或严格限制利用。药物的心血管毒性占药物全部毒性反应的26%。伴随着组合化学、基因组学等学科的迅猛进展，每年新增大量的化合物进入新药研发领域，必定要求在临床前探讨阶段对其心血管毒性进行灵敏、快速、准确及实用的高通量筛选与评价，及早发现心血管毒性，提升新药研发的成功率。目前，用于药物毒性评价的模型有两大类：一类是以细胞、组织为代表的体外评价模型，虽适合高通量毒性筛选，但不能反映动物的新陈代谢和整体生理历程。另一类是以啮齿类为代表的哺乳动物体内评价模型，可以整体水平直观地反映药物的毒性作用，但不适合新药研发早期药物毒性的高通量筛选。由于以上两类策略具有各自的局限性，越来越多的探讨人员利用斑马鱼进行药物毒性的筛选和安全性评价。斑马鱼是一种脊椎方式动物，具有个体小、产卵多、体外受精与发育、发育快、胚胎透明、易于观察、饲养简便等优点。斑马鱼在生理历程、毒性反应方面和人类非常相似。目前，斑马鱼已被欧洲替代法验证中心（ECVAM）推荐为新的替代动物，成为仅次于小鼠的第二优先脊椎方式动物。美托洛尔属于第二代选择性β1受体阻断剂，临床广泛用于治疗高血压、心律失常、心力衰竭等心血管疾病。同时，美托洛尔也具有引起心力衰竭加重、心率过缓等心血管毒性反应。本探讨依据斑马鱼的生理结构优势，以其为方式动物，以心血管系统结构和功能两方面对已知心血管毒性阳性化合物进行安全性评价，探讨斑马鱼模型被用于药物心血管毒性筛选和安全性评价的可靠性。并将斑马鱼心血管毒性评价模型用于美托洛尔心血管毒性机制探讨。本探讨选择斑马鱼胚胎为试验动物，以已知心脏毒性阳性药物阿霉素、布洛芬、5-氟脲嘧啶、利多卡因为受试药物，通过对斑马鱼心血管系统形态学观察、静脉窦-动脉球(SV-BA)距离测量、心率测量评价四种药物的心脏毒性作用特点，对斑马鱼心血管毒性评价模型的有效性进行验证。实验结果表明，4种心血管毒性阳性药物作用48h后，斑马鱼心血管系统出现不同程度的心包水肿、卵黄囊水肿、出血等形态学转变；斑马鱼心脏发育历程受到影响，造成心脏环化不建全，SV-BA距离延长；斑马鱼心脏功能受损，出现心率降低，随着浓度增加心率逐渐降低，呈现显著剂量反应联系。美托洛尔作用24h，可引起斑马鱼胚胎死亡。各实验组斑马鱼胚胎死亡数目随着美托洛尔浓度升高而不断增加，具有显著剂量依赖性。经计算美托洛尔24hLC50为8.1g/L，95%可信区间为6.7～9.7g/L。本探讨对美托洛尔的心脏毒性作用机制进行了初步探讨。以6hpf斑马鱼胚胎为模型，以斑马鱼心血管系统形态学转变、SV-BA间距和心率为毒性终点，通过显微镜下形态观察、测量SV-BA距离和DVC摄像系统测量心率，评价美托洛尔的心血管毒性效应特点。实验结果显示，美托洛尔引起斑马鱼心包水肿、卵黄囊水肿、出血等心血管系统形态学转变；影响斑马鱼心脏发育，破坏环化历程，致使心室和心房空间位置转变，导致SV-BA距离延长，心脏出现线性化。美托洛尔还损害斑马鱼心脏正常生理功能，造成心率降低。通过组织切片和HE染色策略探讨美托洛尔暴露后斑马鱼心脏缩小是否由于心脏心肌组织减少所造成。本实验结果证实，斑马鱼心肌细胞和心肌层减少是导致斑马鱼心脏缩小的主要理由。文献报道心肌细胞凋亡是进行性心力衰竭的主要理由。为了探讨美托洛尔是否引起斑马鱼心肌细胞凋亡，本探讨运用吖啶橙荧光活体染料对斑马鱼心肌细胞凋亡进行初步检测。荧光显微镜下，美托洛尔处理组斑马鱼心脏出现致密亮点，提示美托洛尔可诱导斑马鱼心肌细胞凋亡。为进一步探讨心肌细胞凋亡，利用TUNEL法对斑马鱼心肌凋亡细胞进行量化评价。实验结果显示，美托洛尔处理组心肌细胞凋亡率显著高于对照组。充分说明美托洛尔可诱导斑马鱼心肌细胞凋亡。文献揭示β肾上腺素能受体阻断剂可通过阻断β1肾上腺素能受体抑制心肌细胞凋亡，而通过阻断β2肾上腺素能受体推动心肌细胞凋亡。为深入探讨美托洛尔诱导斑马心肌细胞凋亡的机制，本探讨提取斑马鱼胚胎总RNA，进行逆转录和PCR扩增。电泳结果显示，斑马鱼同时具有β1和β2肾上腺素能受体。Bcl-2家族基因在细胞凋亡的调节中起着非常重要的作用。斑马鱼Bcl-2基因家族、caspase基因家族和人相应基因具有高度同源性。运用半定量PCR策略检测斑马鱼中凋亡调节因子zfBcl-2、zfBax-a和zfcaspase-3、zfcaspase-9基因表达的情况。实验结果表明，美托洛尔诱导斑马鱼zfBcl-2基因表达水平上调，同时上调zfBax-a基因表达，但是zfBax-a基因比zfBcl-2基因的表达量高。由此，zfBcl-2/zfBax-a比值逐渐下降。说明美托洛尔诱导斑马鱼心肌细胞凋亡是通过调节zfBcl-2家族基因表达启动细胞凋亡信号。Caspase酶系作为细胞凋亡的中枢效应器，在细胞凋亡的启动和历程中发挥着及其重要的作用。半定量PCR结果显示，美托洛尔可引起斑马鱼zfcaspase-3和zfcaspase-9基因的表达水平升高。蛋白印迹试验进一步证实美托洛尔可上调斑马鱼细胞凋亡蛋白酶zfcaspase-3表达。上面陈述的实验结果充分表明美托洛尔诱导细胞凋亡与caspase级联激活密切相关。本探讨成功建立了药物心血管毒性高通量筛选和安全性评价斑马鱼模型。通过斑马鱼模型探讨美托洛尔对心血管系统的毒性作用，探讨了其可能机制。结果表明，美托洛尔引起心脏毒性的作用机制是通过影响zfBcl-2和zfBax-a的表达启动细胞凋亡程序，通过caspase级联激活诱导斑马鱼心肌细胞凋亡，这可能是通过阻断β2受体实现的。本探讨的结果为深入探讨β受体阻断剂心血管毒性作用机制和新药研制提供论述依据。关键词：斑马鱼论文心脏毒性论文模型论文美托洛尔论文细胞凋亡论文
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英文缩略词表4-6

摘要6-9

ABSTRACT9-12

前言12-18

第一部分 斑马鱼心脏毒性评价模型的建立18-39

1 材料与策略18-23

2 结果与浅析23-35

3 讨论35-38

4 小结38-39

第二部分 美托洛尔心脏毒性作用机制探讨39-66

1 材料与策略39-49

2 结果与浅析49-62

3 讨论62-64

4 小结64-66

全文总结66-67

全新点67-68

综述68-76