移植PTDmFoxp3抑制小鼠皮肤移植排斥反应

摘要：器官移植是治疗终末期器官疾病的重要策略之一,但移植后的排斥反应仍是影响移植物存活的关键不足。诱导受者产生针对供者器官的特异性免疫耐受,成为当前器官移植探讨的重点。CD4~+CD25~(hi)调节性T细胞(regulatory Tcells,Treg)在器官移植中能够诱导器官特异性免疫耐受,在器官移植领域引起了广泛的关注。但要获得足量的Treg用于临床治疗仍然十分困难。Foxp3在Treg的发生、发育及其生物学功能中起着关键作用,成为Treg细胞的相对特异性标志。转染了外源性鼠Foxp3(mFoxp3)或人FOXP3(hFOXP3)的CD4~+CD25~-非Treg细胞可体现出类似Treg细胞样的表型或抑制Jurkat T细胞增殖功能。HIV-TAT中的蛋白转导结构域(protein transduction domain,PTD)是最常用的蛋白转导肽之一,该功能区域能将与其融合的蛋白跨膜导入几乎所有的组织和细胞中,被其导入细胞的融合蛋白仍然保持其原有的生物学活性。目的:探讨基因工程表达的带有蛋白穿膜结构域的小鼠Foxp3融合蛋白(fusin protein of transduction domain combining with mouse box P3,PTD-mFoxp3),抑制活化的小鼠脾淋巴细胞增殖和延长同种异基因小鼠皮肤移植物存活时间的可行性。策略:1.融合蛋白的表达:在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达PTD-mFoxp3,经Ni~(2+)分离柱纯化PTD-mFoxp3。2.Western-blot浅析PTD-mFoxp3在细胞中的定位:融合蛋白穿膜进入小鼠T淋巴细胞瘤株EL-4细胞中的能力。3.淋巴细胞增殖试验检测PTD-mFoxp3对活化的小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响:取正常C57BL/6小鼠脾淋巴细胞,在体外给予刀豆蛋白A(ConA)刺激,并分别给予不同浓度的PTD-mFoxp3、环孢素A(cyclosporine,CsA)、mFoxp3、PTD-GFP、生理盐水处理,48 h后通过酶标仪检测细胞的增殖程度。4.同种异基因小鼠皮肤移植试验观察PTD-mFoxp3对移植物存活时间的影响:建立以Balb/c小鼠移植到C57BL/6小鼠的皮肤移植模型,各组分别以PTD-mFoxp3、CsA、生理盐水(NS)、PTD-GFP于手术当天开始连续腹腔注射8天为干预手段。术后第9天各组随机取两只移植小鼠,采集皮片标本,进行组织学检查。各组其余的8只小鼠用于观察移植皮片的存活时间。结果:1.成功表达并纯化了PTD-mFoxp3。2.通过Western-blot浅析证实PTD-mFoxp3能够穿入EL-4细胞并主要出现在细胞核。3.在淋巴细胞增殖反应检测中,PTD-mFoxp3各浓度组(320、640、1280nM)和CsA组(浓度1μg/ml)相似,与各对照组相比ConA活化的小鼠脾淋巴细胞增殖指数显著降低(P＜0.05)。4.器官移植后第9天移植皮片病理学检查显示:NS组和PTD-GFP组皮肤移植物中可见大量淋巴细胞浸润。PTD-mFoxp3组、CsA组移植物中淋巴细胞浸润显著轻于NS组、PTD-GFP组。5.各组皮肤移植物存活时间:PTD-mFoxp3组为13.6±1.50天,CsA组为14.2±1.28天,NS组为10.0±1.07天,PTD-GFP组为10.5±1.31天。经单因素方差浅析表明四组之间有显著性差别。两两比较,PTD-mFoxp3组和CsA组移植物的存活时间较NS组和PTD-GFP组显著延长(P＜0.05)。结论:1 PTD-mFoxp3能抑制活化的小鼠脾淋巴细胞的增殖。2 PTD-mFoxp3具有延长同种异基因小鼠皮肤移植物存活时间,减轻移植物周围炎症反应的能力。关键词：PTD-mFoxp3论文免疫抑制论文移植排斥论文

摘要6-9

ABSTRACT9-15

引言15-17

第一章 探讨目的、策略、实验设计案例和作用17-19

1.1 探讨目的、策略17

1.2 本探讨的作用17

1.3 实验案例的设计17-19

第二章 实验材料19-21

2.1 主要仪器19

2.2 试剂19-20

2.3 主要溶液及配制20-21

第三章 实验策略21-25

3.1 PTD-mFoxp3的表达纯化21-22

3.1.1 融合蛋白的诱导表达21

3.1.2 细菌的裂解21

3.1.3 蛋白纯化21

3.1.4 蛋白质的SDS-PAGE电泳鉴定21-22

3.2 Western-blot浅析22-23

3.2.1 融合蛋白转导EL-4细胞22

3.2.2 提取胞核及胞浆蛋白22

3.2.3 免疫印迹检测22-23

3.3 脾淋巴增殖反应试验23

3.4 动物实验23-24

3.4.1 小鼠同种异体皮肤移植模型的建立策略23-24

3.4.2 实验分组设计24

3.4.3 病理切片24

3.5 统计学处理24-25

第四章 实验结果25-29

4.1 体外实验结果25-27

4.1.1 融合蛋白的诱导表达结果25

4.1.2 融合蛋白转导EL-4细胞Western-blot浅析结果25-26

4.1.3 脾淋巴细胞增殖试验结果26-27

4.2 体外实验结果27-29

4.2.1 器官移植后一般情况观察27

4.2.2 移植物的病理学检查27-28

4.2.3 移植皮片存活情况28-29

第五章 讨论29-34

第六章 主要结论及展望34-35

6.1 主要结论34

6.2 展望34-35