谈述亚铁浸矿微生物硫酸盐同化和重金属抗性耦合作用机制网

摘要：我国矿产资源的显著特点是品位低、复杂、难处理和中小型矿居多,传统的选冶工艺很难进行经济、绿色、有效地提取。生物冶金具有低成本、短流程、污染小等优点,具有广阔的运用前景。浸矿微生物浸出一段时间之后,其生长的环境中就会富含高浓度的硫酸盐及有毒重金属离子,这是制约其浸出时间、浸出效率的重要的环境因素。而在微生物的解毒机制中,硫酸盐的同化途径可能发挥了重要的作用,因而对于浸矿微生物重金属的抗性机制,以及硫酸盐同化与重金属解毒耦合作用机制的探讨,对微生物适应极端环境的分子机制的揭示,对浸矿历程中,重金属的耐受和浸矿效率的提升,以及在环境领域更广阔的运用其抗性机制,都将具有非常重要的作用。本论文旨在对浸矿微生物的重金属抗性机制进行深入的探讨,探讨浸矿微生物的重金属抗性以及与硫酸盐同化的内在联系,探讨工作主要有以下几个方面：①浸矿微生物重金属抗性机制的初步探讨在本探讨给定的重金属浓度下, A. ferooxidans体现出了显著的抑制作用并且随着重金属浓度的增加,抑制作用越显著。适合探讨的Cd2+、Zn2+、Pb2+三种重金属耐受浓度分别为Cd2+(5mM、15mM、30mM), Zn2+(150mM、300mM、600mM), Pb2+(2.5mM、5mM、10mM)。在Cd2+胁迫下,通过测定镉离子的亚细胞结构镉离子含量、细菌细胞体内GSH的含量、硫酸根离子浓度、硫酸盐同化途径的相关酶类的酶活,结果表明其可能有着的抗性机制有细胞累积、排出系统、以及生物转化或螯合等几种方式。在Zn2+胁迫下,通过测定菌体内GSH的含量、Cys含量、硫酸盐同化途径的相关酶类酶活,结果表明,随着Pb2+浓度的增加,其体内GSH含量有所增加,Cys含量的变化不显著,硫酸盐同化途径的相关酶类也有所变化,但是却是体现为先增加后降低,说明硫酸盐同化途径可能对锌离子的抗性有一定的作用,但是在浓度更大的情况下,硫酸盐同化途径可能已经不能满足细菌菌体的需要,其可能启动了更多的重金属抗性机制。在Pb2+的胁迫下,通过测定菌体内GSH的含量、Cys含量、硫酸盐同化途径的相关酶类的酶活,结果表明,谷胱甘肽、半胱氨酸的含量,随着Pb2+浓度的增大而降低,硫酸盐同化相关酶类的活性有所变化但是却与Cd2+的情况相反,说明Pb2+胁迫菌体情况下硫酸盐同化对抗性的贡献可能不显著,或是与Cd2+相反。②浸矿微生物重金属抗性基因的差别表达浅析通过生物信息学的浅析,发现了十个可能与重金属抗性相关的基因。利用Real-time PCR技术,对Cd2+胁迫下重金属抗性基因的差别表达情况进行了考查,结果表明,在不同浓度的Cd2+刺激下,重金属抗性基因在转录水平上的表达量,均呈上调走势,相对对照组大约上调了1-8倍,且随着Cd2+浓度的增加,上调倍数也随之增加。预测Cd2+的转运模型为Czc操纵子是由H+离子梯度驱动,由位于内膜上的QcA1,2A将重金属Cd(Ⅱ)泵出到细胞质,然后由CzcB1A,f(?)将重金属穿梭至外膜,并预防重金属进入周质,CzcB1A,f也可以提供其他重金属的特异性。CzcC1A,f则完成将重金属排出到外部环境的全历程。CmtR是重金属的转录调控因子,位于胞内,作为识别的信号。CadB1A,f和CadB2A,f是转运体,帮助CzcB1A,f将重金属运出体外。在Zn2+胁迫下,重金属抗性基因的表达差别情况结果表明,在不同浓度的Zn2+胁迫下,重金属抗性基因在转录水平上的表达量也是呈上调走势,大约是对照组的1.2到630倍,且随着Zn2+浓度的增加,上调倍数也随之增加,说明这些基因的表达情况,大部分与Cd2+胁迫下情况相似。但是CzcABCAf重金属排出系统的基因(AFE-0671CzcA1A,f、AFE-1144CzcA2A,f、AFE-1142CzcC1A,f和AFE-1143CzcB1A,f)变化不大,说明对于Zn2+的抗性的贡献可能不是很大,而基因AFE-2437CadB1A,f、AFE-2438CadB2A,f、AFE-2920CadB3A,f这三个转运蛋白,在Zn2+胁迫下,却是随着重金属浓度的增大而逐渐增加的,说明转运蛋白对于锌离子的抗性贡献较大。在Pb2+胁迫下,重金属抗性基因的表达差别情况探讨发现,在不同浓度的Pb2+胁迫下,重金属抗性基因在转录水平上的表达量均呈下调走势,且随着Pb2+浓度的增加,并没有显著的调控走势,说明在Pb2+胁迫下大多数抗性基因,没有体现出显著的调控或者为负调控。③重金属胁迫下硫酸盐同化途径相关基因的表达差别浅析通过生物信息学浅析,找寻到硫酸盐同化的相关的关键基因,对其进行体外重组表达和酶活浅析,确定了硫酸盐同化的基本代谢路径。被运输到体内的硫酸盐被cysDN编码的ATP硫酸化酶激活为APS(adenosine-5'-phosphosulfate),随后被APS还原酶还原为亚硫酸盐,亚硫酸盐又被cysJI编码的亚硫酸盐还原酶还原为硫化物,最后硫化物与O-乙酰丝氨酸由cysM编码的半胱氨酸合成酶同化入半胱氨酸。通过对重金属胁迫下硫酸盐同化途径相关基因的表达差别浅析,结果表明在Cd2+胁迫下,硫酸盐同化的相关基因的表达,体现为上调走势,大约是对照组的1到3倍,随着离子浓度的增大,上调倍数越大。但是锌离子胁迫下只有少数几个基因表达上调,而铅离子胁迫下,则没有显著的上调。表明硫酸盐同化基因对于镉离子的抗性的较大,而对其他两种金属离子则较小④浸矿微生物重金属抗性关键基因的过表达浅析探讨发现,CysE和CmtR基因是转录调控作用的关键的抗性基因,为了进一步的了解其功能,采取过表达浅析的策略考查了其转入受体菌之后的抗性的变化。结果表明：在不同浓度Cd2+的胁迫下,BL21导入重金属抗性基因后,相对于对照组,菌体的生物量,没有显著的变化,但是其体内Cys和GSH的含量却有所增加,同时体内的重金属含量也是有所增加,说明导入抗性基因后其重金属的抗性显著增强；不同浓度Zn2+的胁迫下,BL21导入重金属抗性基因后,其相应的结果与Cd2+相似,说明导入抗性基因后其重金属抗性增强；不同浓度Pb2+的作用下,BL21导入重金属抗性基因后,无论是菌体的生物量、Cys和GSH的含量,还是其体内的重金属含量,相对于对照组均是降低的,说明导入抗性基因后其重金属抗性没有显著的改善或者是下降的。⑤重金属浸出及其种群优势度的浅析16S rDNA-RFLP浅析结果表明,所选取的三个AMD(酸性矿坑水)采样点中,均含有Acidithiobacillus菌属的微生物,每个样点均有部分菌株独立于已知菌株有着,独立有着的菌株数目占所考查菌株数目的一半左右；并且三个样点之间浸矿微生物的种类及数量相似度较大,说明这三个考查点其中的地球化学环境相似。用AMD对四种不同组成的矿石浸出后,发现其对Ag、Pb及Cu有一定的浸出能力,而对As和Pb几乎没有浸出效果。微生物群落浅析得出：H71和F11群落结构差别较大,而J72和S71几乎一样。以系统发育浅析可知,所考查的序列可分为两大分支：Acidithiobacillus菌属和相对独立的菌属,不同矿石样品处理后均有着这两支,且发育距离较近。关键词：浸矿微生物论文嗜酸氧化亚铁硫杆菌论文重金属抗性论文硫酸盐同化论文基因差别表达论文过表达浅析论文

摘要5-8

ABSTRACT8-12

缩略词表12-18

第一章 文献综述18-34

1.1 生物冶金概述18-20

1.1.1 浸矿微生物18-19

1.1.2 环境中的金属离子对浸矿微生物的影响19

1.1.3 浸矿微生物对环境中的金属离子的抗性机制19-20

1.2 重金属的抗性机制探讨进展20-25

1.2.1 重金属解毒机制20-23

1.2.2 重金属抗性基因23-24

1.2.3 重金属转录调控因子探讨概况24-25

1.3 硫酸盐同化对重金属抗性的贡献25-31

1.3.1 硫酸盐同化途径的关键酶27-29

1.3.2 硫酸盐同化途径的调控29

1.3.3 丝氨酸乙酰转移酶探讨概况29-31

1.4 论文探讨的目的作用31-32

1.5 论文的主要探讨内容32-33

1.6 论新性33

1.7 论文课题来源33-34

第二章 浸矿微生物重金属抗性机制探讨34-50

2.1 引言34-35

2.2 材料与策略35-40

2.2.1 菌种35

2.2.2 培养基35

2.2.3 浸矿微生物生长情况的测定策略35-36

2.2.4 菌体的培养36

2.2.5 粗蛋白的提取36

2.2.6 亚细胞结构中重金属离子含量的测定36-37

2.2.7 硫酸根(SO_4~(2-))浓度的测定37

2.2.8 半胱氨酸(Cys)含量的测定37-38

2.2.9 谷胱甘肽(GSH)含量的测定38-39

2.2.10 硫酸盐同化途径相关酶类活性的测定39-40

2.3 结果与讨论40-49

2.3.1 Cd~(2+)对菌体生长的影响情况40

2.3.2 Cd~(2+)在细菌的亚细胞结构中的分布40-41

2.3.3 Cd~(2+)对菌体内谷胱甘肽(GSH)含量的影响41-43

2.3.4 Cd~(2+)对菌体内硫酸根含量的影响43

2.3.5 Cd~(2+)对菌体内硫酸盐同化途径相关酶类活性的影响43-44

2.3.6 Zn~(2+)对菌体生长的影响情况44-45

2.3.7 Zn~(2+)对A.ferrooxidans细胞内Cys、GSH含量的影响45-46

2.3.8 Zn~(2+)对菌体内硫酸盐同化途径相关酶类活性的影响46-47

2.3.9 Pb~(2+)对菌体生长的影响情况47-48

2.3.10 Pb~(2+)对A.ferrooxidans细胞内Cys、GSH含量的影响48

2.3.11 Pb~(2+)对菌体内硫酸盐同化途径相关酶类活性的影响48-49

2.4 小结49-50

第三章 浸矿微生物重金属抗性基因的表达差别浅析50-71

3.1 引言50

3.2 重金属抗性基因的选取50-51

3.3 材料和策略51-57

3.3.1 试剂与仪器51-52

3.3.2 RNA的提取及纯化52-53

3.3.3 反转录cDNA合成53-54

3.3.4 制备反转录和非反转录样品54

3.3.5 引物设计54-56

3.3.6 内参基因的选择56

3.3.7 引物检测56

3.3.8 标准品制备56

3.3.9 Real-time PCR检测56-57

3.3.10 Real-time PCR检测结果的浅析57

3.4 重金属抗性基因的生物信息学浅析57-58

3.4.1 序列同源性比对57

3.4.2 蛋白质基本数据的计算57-58

3.4.3 亚细胞结构定位58

3.4.4 信号肽(Signal Peptide)预测58

3.4.5 跨膜结构域浅析58

3.4.6 保守区域预测58

3.5 结果与讨论58-70

3.5.1 总RNA质量浅析58-59

3.5.2 cDNA质量浅析59-60

3.5.3 引物质量评估60

3.5.4 标准曲线和熔解曲线浅析60

3.5.5 重金属抗性基因的生物信息学浅析60-64

3.5.6 不同浓度Cd~(2+)刺激下重金属抗性基因的差别表达64-67

3.5.7 Cd~(2+)胁迫下重金属抗性机制的模型的预测67-68

3.5.8 不同浓度Zn~(2+)刺激下重金属抗性基因的差别表达68-69

3.5.9 不同浓度Pb~(2+)刺激下重金属抗性基因的差别表达69-70

3.6 小结70-71

第四章 重金属胁迫下硫酸盐同化途径相关基因的表达差别浅析71-88

4.1 引言71-72

4.2 实验材料与策略72-74

4.2.1 菌种72

4.2.2 培养基72

4.2.3 工具酶及其他试剂72-73

4.2.4 SDS-PAGE电泳的试剂配置73

4.2.5 蛋白亲和纯化试剂的配置73-74

4.3 实验策略74-80

4.3.1 基因组的提取74

4.3.2 目的基因克隆74-77

4.3.3 目的蛋白的表达纯化77-78

4.3.4 用SDS-PAGE验证已纯化的目的蛋白78-79

4.3.5 硫酸盐同化途径的相关酶的活性浅析79

4.3.6 基因的差别表达浅析79-80

4.4 结果与讨论80-87

4.4.1 硫酸盐同化基本代谢路径的浅析80-82

4.4.2 硫酸盐同化代谢途径的确定82-83

4.4.3 Real-time PCR检测浅析83-84

4.4.4 不同浓度Cd~(2+)肋迫下硫酸盐同化相关基因的差别表达84-85

4.4.5 不同浓度Pb~(2+)胁迫下硫酸盐同化相关基因的差别表达85-86

4.4.6 不同浓度Pb~(2+)胁迫下硫酸盐同化相关基因的差别表达86-87

4.5 小结87-88

第五章 浸矿微生物重金属抗性关键基因的过表达浅析88-99

5.1 引言88

5.2 实验材料与策略88-89

5.2.1 培养基88

5.2.2 质粒的酶切反应系统88-89

5.2.3 Cys测定试剂89

5.2.4 GSH测定试剂89

5.3 实验策略89-90

5.3.1 pCysE和pCmtR重组质粒的提取89

5.3.2 pCysE和pCmtR蛋白的验证89

5.3.3 重金属刺激菌体的诱导表达89-90

5.3.4 菌体吸光度OD_(600)的测定90

5.3.5 Cys含量的测定90

5.3.6 GSH含量的测定90

5.3.7 细胞内重金属的含量测定90

5.4 实验结果及讨论90-97

5.4.1 p CmtR-BL21、pCysE-BL21重组菌体的验证90-91

5.4.2 不同浓度Cd~(2+)的刺激下菌体相关指标的测定结果91-94

5.4.3 不同浓度Zn~(2+)的刺激下菌体相关指标的测定结果94-96

5.4.4 不同浓度Pb~(2+)的刺激下菌体相关指标的测定结果96-97

5.5 小结97-99

第六章 重金属浸出及其浸出历程中种群优势度的浅析99-116

6.1 引言99

6.2 实验材料与策略99-105

6.2.1 菌种99

6.2.2 培养基99

6.2.3 样品的采样与化学参数测定99-100

6.2.4 样品的预处理100

6.2.5 菌落多样性的浅析策略100-103

6.2.6 RFLP浅析与统计浅析103-104

6.2.7 系统发育树的建立104

6.2.8 浸矿策略104

6.2.9 重金属浸出率的浅析104-105

6.3 结果与讨论105-114

6.3.1 采样点的化学参数测定浅析105

6.3.2 AMD样品菌落多样性的浅析105-110

6.3.3 重金属的浸出率浅析110-114

6.4 小结114-116

第七章 结论与展望116-119

7.1 全文总结116-118

7.2 不足不足及探讨展望118-119