简论短乳杆菌CCTCCM208054生物转化制备γ氨基丁酸与其GAD系统关键基因

摘要：γ-氨基丁酸是一种非蛋白质组成的天然氨基酸,广泛有着于自然界。γ-氨基丁酸是哺乳动物中枢神经系统的一种主要抑制性递质,具有多种生理功能,可作为生物活性因子运用于食品、医药和饲料工业。我国己批准γ-氨基丁酸作为新资源食品用于食品生产加工。本论文就高产γ-氨基丁酸乳酸菌的分离鉴定,Y-氨基丁酸的检测策略,发酵工艺的建立优化,产物的分离纯化,以及关键基因浅析进行了较深入的探讨,主要结果如下。1.建立了预染纸色谱策略用于氨基酸的高通量定性浅析,预染纸色谱-分光光度法用于γ-氨基丁酸的高通量定量。预染纸色谱的操作策略为：滤纸在含茚三酮的展开剂(正丁醇：冰乙酸：水=5：3：2,v/v/v)中展开后,直接加热显色。预染纸色谱能将谷氨酸和γ-氨基丁酸完全分开,氨基酸斑点致密,避开了传统纸色谱的拖尾和重叠现象。优化了影响γ-氨基丁酸与茚三酮显色的重要因素如茚三酮浓度、显色温度、显色时间和Cu2+浓度等,使显色反应完全、生色基团稳定。优化上面陈述的因素后,将预染纸色谱偶联分光光度法用于γ-氨基丁酸的定量,实验条件为：准确吸取2μL样品点样,色谱纸在含1.2%茚三酮的展开剂中展开后,70℃显色80min,将γ-氨基丁酸-茚三酮斑点以色谱纸上剪下,置于5mL洗脱液(75%乙醇：0.6%CuS04·5H20=38：2,v/v)中,40℃50rpm震荡洗脱60min,测定洗脱液在512nm处的光吸收值。结果表明,策略在0.50～20.00g/L的浓度范围内线性联系良好(R2=0.998),相对标准偏差RSD2.64%,回收率102.7～103.9%。利用预染纸色谱-分光光度法和Hplc同时测定样品的GABA浓度,两种策略的测定结果无显著性差别,表明所建立的策略可用于Y-氨基丁酸的定量。2.以泡菜中分离到高产γ-氨基丁酸的短乳杆菌NCL912。利用纸色谱初筛、HPLC复筛,以1000余株分离自泡菜样品的乳酸菌中筛选到23株产γ-氨基丁酸的疑是细菌,其中菌株NCL912的产量最高(15.37g/L)。经LC-MS测定,NCL912转化产物的分子量与γ-氨基丁酸标准品完全一致。上面陈述的结果表明,NCL912确实能转化谷氨酸,且转化产物为Y-氨基丁酸。根据表型特点、生理生化特性和16SrDNA全序列比对,鉴定NCL912为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)。该菌现保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCCM208054(=NCL912)。3.设计并优化了Lactobacillus brevis CCTCCM208054产Y-氨基丁酸的发酵培养基。用单次单因子策略筛选到影响γ-氨基丁酸合成的四个重要因子为葡萄糖、大豆蛋白胨、Tween-80和MnSO4·4H2O,并确定了各重要因子的合适浓度范围。然后利用响应面策略对重要因子进行浅析,确定了四个因子的最佳水平,分别为55.25g/L、30.25g/L、1.38mL/L和0.0061g/L。在各因子的最佳水平条件下,模型预测γ-氨基丁酸产量为36.06g/L,验证实验中实测值为35.66g/L,二者基本一致。优化发酵培养基后,CCTCCM208054的γ-氨基丁酸产量比优化前提升了130%。4.考察了5’-磷酸吡哆醛、温度、pH和初始谷氨酸钠浓度对CCTCCM208054生长和合成γ-氨基丁酸的影响。5’-磷酸吡哆醛对细胞生长和γ-氨基丁酸合成没有影响；温度、pH和初始谷氨酸钠浓度则有重要影响,最佳水平分别为30～35℃、5.0和0.25～0.50M。在此基础上,建立了CCTCCM208054合成γ-氨基丁酸的补料分批发酵工艺如下。种子培养基(g/L)：葡萄糖50,大豆蛋白胨25,MnSO4·4H2O0.01,Tween-802mL/L,MSG0.5M,pH5.0；发酵培养基除葡萄糖为35g/L、MSG为0.4M外,其余成分与种子培养基相同；CCTCCM208054在种子培养基中32℃培养约10h(A600=4.0～6.0)作为种子液；补料分批发酵的具体参数为：发酵培养基3L,接种量10%(v/v),培养温度32℃,搅拌速度100rpm,发酵周期48h,12h和24h时分别补入280g和112gMSG,整个历程用5M H28O4制约pH5.0。发酵48h时,发酵液中γ-氨基丁酸浓度达到102.78±5.30g/L,无谷氨酸钠和葡萄糖残留。5.通过离心、活性炭脱色、70%乙醇脱盐、离子交换色谱精制和乙醇结晶的策略,以发酵液中分离纯化γ-氨基丁酸。产品回收率约为50%；产品纯度达98.66±2.36%。6.克隆到了CCTCCM208054的gadA及其侧翼序列,以上游至下游依次为：乙酰转移酶基因(act)、PgadR、gadR、Pgad、gadC、gadA和谷氨酰-tRNA合成酶基因(gts),与Lactobacillus brevis ATCC367中相应的基因结构类似,但ATCC367的PgadR上游为NADPH-醌还原酶相关的锌依赖氧化还原酶基因。CCTCCM208054的gadR、gadC、gadA与ATCC367的同源性分别为66%、79%、79%,编码蛋白的同源性分别为66%、91%、91%；CCTCCM208054的act与gadR的间隔区、gadR与gadC的间隔区、gadC与gadA的间隔区长度分别为278、210、59bp,而ATCC367相应的间隔区长度分别为270、193、55bp；两株菌的上面陈述的间隔区的同源性分别为43%、58%、62%。CCTCCM208054的gadA和gadC的间隔区或其附近序列中不有着任何转录信号,表明gadCA可能形成操纵子结构。不能直接扩增到CCTCCM208054的gadB,但扩增到了其醛酮还原酶基因(akr)(ATCC367的akr距gadB仅1003bp),往CCTCCM208054的akr下游步移了3027bp也未发现gadB,提示CCTCCM208054中可能没有gadB。7.利用实时荧光定量PCR探讨了添加与不添加MSG的条件下,CCTCCM208054的gadA、gadC和gadR在不同培养时期的转录情况。MSG可以诱导三个基因表达；gadC和gadA的转录量一致；与Lc. Lactis的gadR为组成型表达不同,CCTCCM208054的gadR和gadCA同步转录,且转录量大幅高于gadA和gadC,因时期不同为后者的14～156倍。上面陈述的结果表明,CCTCCM208054可能通过以下三个方面实现了高产GABA:(1)可能通过优化GAD系统的功能基因和调控序列,提升了gadCA的转录量以及GadA和GadC的活性；(2)可能通过gadCA组成操纵子结构实现了gadC和gadA同步表达,使脱羧反应和氨基酸运送相协调；(3)可能通过gadR的高表达保障了gadCA正常转录。关键词：短乳杆菌CCTCCM208054论文γ-氨基丁酸论文生物转化论文预染纸色谱论文GAD系统论文基因浅析论文

摘要9-12

Abstract12-16

符号与縮写索引16-17

第一章 前言17-40

1.1. GABA概述17-19

1.2. 食品中GABA的原位富集19-20

1.3. 生物法制备GABA20-25

1.3.1. 利用动植物组织或细胞制备20

1.3.2. 利用微生物制备20-21

1.3.3. 乳酸菌合成GABA21-25

1.3.3.1. 乳酸菌合成GABA的机制、历程与功能21-22

1.3.3.2. 乳酸菌合成GABA的优势22

1.3.3.3. 产GABA的乳酸菌、分离源与筛选对策22-23

1.3.3.4. 产GABA乳酸菌的运用领域23-25

1.3.3.4.1. 大规模发酵制备GABA23-24

1.3.3.4.2. 作为功能性发酵剂24

1.3.3.4.3. 作为益生菌24-25

1.4. 合成GABA的关键酶及其分子基础25-30

1.4.1. 哺乳动物GAD25

1.4.2. 植物GAD25

1.4.3. 微生物GAD25

1.4.4. 乳酸菌GAD25-30

1.5. 探讨目的、作用和内容30-31

1.5.1. 探讨目的和作用30-31

1.5.2. 探讨内容31

.2.2. 大豆蛋白胨浓度的影响68-69

4.3.2.3. Tween-80浓度的影响69

4.3.2.4. MnSO_4·4H_2O浓度的影响69

4.3.3. R策略进一步优化关键因子69-72

4.4. 讨论72-74

4.4.1. 影响GABA合成的重要因子72-73

4.4.2. 重要因子的最佳水平73-74

4.5. 小结74