摘要：Bcl-2(B-cell lymphoma-2)家族蛋白是细胞凋亡通路的关键调控因子,包括抗凋亡成员(Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、Bcl-W和A1)与两类促凋亡成员：多域蛋白(Bax、Bak)和BH3-only蛋白(Bom、Puma、Noxa、Bad、Bid、Bmf、Bik和Hrk)。它们之间发生蛋白-蛋白相互作用,调控内源性细胞凋亡通路。探讨表明,相当一部分实体瘤细胞和血液肿瘤细胞内源高表达Bcl-2抗凋亡蛋白,由此逃避凋亡,得以永生。例如在急性髓系白血病AML (Acute myelocytic leukemia)中,Mcl-1(Myeloid cell leukemia-1)的高表达特性是白血病细胞得以持续生长和扩散的关键因子。多域蛋白中的Bax (Bcl-2-associated x protein)蛋白和Bak(Bcl-2homologous antago-nist/killer)蛋白是调控内源性细胞凋亡通路的效应因子。它们直接导致线粒体膜通透性增高,促使细胞凋亡。但是,两个效应因子Bax和Bak之间的地位是否等同,机体细胞中有着两个效应因子是否显得冗余,至今仍然有着争论。大多数传统模型表明Bak和Bax在细胞凋亡进程中相互进行补偿。但是在某些情况下,两个蛋白则分别行使各自的功能。Bcl-2蛋白抑制剂通过拮抗Bcl-2促凋亡蛋白,释放Bax和Bak,诱导细胞凋亡,发挥抗肿瘤的作用。目前进入临床试验期治疗AML的小分子BH3模拟物包括ABT-737,AT-101, Obatoclax。然而,AML对于ABT-737显示出抗性,因为ABT-737不能够有效的拮抗Mcl-1蛋白。AT-101, Obatoclax虽然能够同时拮抗Bcl-2和Mcl-1蛋白,但其诱导凋亡,并不是完全通过依赖Bak/Bax途径,对正常细胞的非特异性毒性,限制了其临床运用。小分子S1是一个我们实验室探讨发现的特异性的BH3模拟物。已经证明S1是通过依赖Bax/Bak的内源性凋亡通路诱导肿瘤细胞凋亡,由此S1在诱导肿瘤细胞凋亡的历程中体现出高效、低毒的优势。尤其是它对Mcl-1蛋白具有很高的亲和力(Ki=58nM),显著高于已经处于临床试验阶段的同类分子ABT-737。由此,S1可能在ABT-737耐药的AML细胞中发挥高效抗癌活性。本论文的探讨目的是探讨小分子S1在AML细胞系和原代AML细胞中的抗癌分子药理学机制和肿瘤分子标志物(Tumor Marker),为S1未来的临床试验提供指导。肿瘤分子标志物是反映肿瘤有着的化学类物质。它们或不有着于正常成人组织而仅见于胚胎组织,或在肿瘤组织中的含量大大超过在正常组织里的含量,它们的有着或量变可以提示肿瘤的性质,借以了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能,以帮助肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。由此,探讨肿瘤标志物对于肿瘤的预防,检测和治疗的作用非常重大。首先,我们将S1作用于三株AML细胞系和二十七例AML患者的原代细胞。通过Annexin V-FITC-PI双染以及流式细胞仪检测、Caspase检测、免疫共沉淀等实验证明了S1在AML细胞通过内源凋亡通路诱导细胞凋亡,诱导历程完全依赖Bax/Bak蛋白。S1在不同细胞中的敏感性差别很大(EC_50范围在500nM-80μM)。通过统计学浅析,证明单一Bcl-2家族蛋白的表达量不能作为S1的预测分子标志物,而S1诱导的Bak蛋白的激活量与S1的敏感性线性相关性。最后,通过合成S1衍生物,能促使Mcl-1蛋白的泛素化以而增强Bak蛋白的激活,提升S1在AML中的敏感性。我们的探讨确定了S1诱导的Bak蛋白的激活量是S1在AML中的分子标志物。关键词：S1论文急性髓系白血病(AML)论文Bcl-2家族蛋白论文Mcl-1论文
摘要4-6
Abstract6-10
第一章 文献综述10-25
1.1 引言10
1.2 细胞凋亡通路是肿瘤生成的关键调节因子10-12
1.3 细胞凋亡途径12-14
1.3.1 外源细胞凋亡通路12-14
1.3.2 内源性细胞凋亡通路14
1.4 Bcl-2家族蛋白是内源性细胞凋亡途径的顶点和核心因子14-17
1.4.1 Bcl-2家族蛋白的结构特点14-15
1.4.2 Bcl-2家族蛋白调控凋亡的机制15-17
1.5 Mcl-1在Bcl-2家族网络中的作用17-20
1.5.1 Mcl-1是Bak蛋白的"Guard"17-18
1.5.2 Mcl-1蛋白的泛素化18-19
1.5.3 Mcl-1蛋白的磷酸化19-20
1.6 Bcl-2小分子抑制剂20-23
1.6.1 Bcl-2小分子抑制剂的作用机制20-22
1.6.2 特异性Bcl-2蛋白家族小分子抑制剂S122-23
1.7 肿瘤分子标志物23
1.8 本探讨工作的指导思想和主要目标23-25
第二章 S1在白血病细胞中的分子药理机制探讨25-47
2.1 引言25
2.2 实验试剂与设备25-26
2.3 实验策略26-33
2.3.1 细胞的培养及化合物处理26-27
2.3.2 原代急性髓系白血病样品的获得27-28
2.3.3 病人骨髓样品的单个核细胞的密度梯度离心提取28
2.3.4 非放射性细胞增殖检测(MTS)28-29
2.3.5 FITC-Annexin V/PI双染色法浅析细胞凋亡29
2.3.6 Western Blot免疫印记29-32
2.3.7 线粒体膜电位检测32
2.3.8 免疫共沉淀实验32-33
2.3.9 S1诱导Bax/Bak蛋白构象激活检测33
2.3.10 统计浅析33
2.4 结果与讨论33-46
2.4.1 S1通过内源性凋亡途径诱导白血病细胞凋亡33-37
2.4.2 S1依赖Bak/Bax蛋白诱导细胞凋亡37-38
2.4.3 S1在白血病细胞系间具有不同的敏感性38-39
2.4.4 S1在原代AML细胞中具有不同的敏感性39-40
2.4.5 单一Bcl-2家族蛋白表达量不能预测S1的敏感性40-42
2.4.6 S1诱导凋亡作用与细胞中Bak蛋白释放量线性相关42-46
2.5 本章小结46-47
第三章 S1衍生物在白血病细胞中的分子药理机制探讨47-56
3.1 引言47
3.2 实验试剂与设备47-48
3.3 实验策略48-50
3.3.1 细胞的培养及化合物处理48-49
3.3.2 免疫共沉淀实验49
3.3.3 Western Blot免疫印记49-50
3.3.4 非放射性细胞增殖检测(MTS)50
3.4 结果与讨论50-54
3.4.1 S1衍生物4g在K562细胞系中高效诱导细胞凋亡50-51
3.4.2 4g推动Mcl-1的泛素化提升Bak蛋白的释放量51-54
3.5 本章小结54-56
结论56-57
本站原创