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[摘要] 目的 观察Midine（MK）在原发性胆囊癌中的表达情况，并探讨其与原发性胆囊癌临床病理指标之间的关系。 方法 选择1995年1月～2003年6月胆囊癌53例、腹腔转移灶12例、淋巴结转移灶12例和正常胆囊20例、胆囊腺瘤14例，均采用免疫组织化学方法检测MK在其中的表达情况；结合53例胆囊癌患者临床病理资料分析MK表达指数与组织学类型、分化程度、临床分期、局部淋巴结转移、肝脏浸润及腹腔广泛转移的关系。 结果 正常胆囊、胆囊腺瘤与原发性胆囊癌的MK表达标记指数（LI）中位数分别为0%、17%（5%，29%）、72%（41%，98%），三者比较差异有高度统计学意义（P < 0.01）；胆囊淋巴结转移灶及腹腔转移灶Midkine表达LI的中位数分别为90%（76%，100%）、88%（65%，100%），二者Midkine表达LI与原发灶比较，差异有统计学意义（P < 0.05 ）；结合临床病理资料统计分析发现，胆囊癌的分化程度越低，Midkine表达LI越高，差异有统计学意义（P < 0.05）；Midkine在晚期胆囊癌中表达LI水平高于早中期，差异有统计学意义（P < 0.05）；Midkine在伴有肝脏浸润灶中表达LI水平高于不伴肝脏浸润，差异有统计学意义（P < 0.05）；Midkine在伴有广泛腹腔转移中表达LI水平高于不伴腹腔广泛转移，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 Midkine可作为胆囊癌新的标记物；Midkine表达与胆囊癌发生、发展有关，对胆囊癌的临床分期、浸润转移的估计和病人预后的判断有一定意义。
[关键词] Midkine；表达；胆囊肿瘤；免疫组织化学
[] A [文章编号] 1673-7210（2013）06（a）-0016-03
Midkine（MK）是一种肝素结合性生长分化因子，已有研究表明，MK在多种人类恶性肿瘤组织中可检测到并呈过度表达[1-4]。越来越多的证据表明，MK参与了肿瘤的多种恶性生物学行为，如增殖、迁移、表型转化和血管生成。深入研究MK分子的表达及其与相关临床指标的关系具有重要意义。
原发性胆囊癌发病过程隐匿，且侵袭力强，预后较差，大部分患者在发病后1年内死亡，3年生存率低于11%[5-7]。目前对MK分子在胆囊癌组织中的表达情况及其在胆囊癌发生和演进中所扮演的角色缺乏认识。本研究采用免疫组织化学技术研究胆囊癌、胆囊腺瘤及正常胆囊中MK表达情况，并结合临床病理资料进行统计分析，初步探讨MK分子表达水平与胆囊癌临床病理特征的关系。
2 结果
胆囊癌细胞质及细胞膜呈现棕红色细颗粒状染色，胞核或胞膜单独阳性反应者标记为MK表达阳性（图1）；胆囊腺瘤组织中亦见少量上皮细胞染色，多为胆囊腔的上皮细胞，腺瘤实质内上皮细胞少见染色（图2）。正常胆囊中均未见MK表达。
2.3 MK表达与胆囊癌组织学分型及分化程度的关系 53例胆囊癌中腺癌41例，MK表达的LI为70%（41%，86%）；其他（鳞癌、黏液癌）12例，MK表达的LI为75%（50%，98%）。两者比较差异无统计学意义（P > 0.05）。按其分化程度属高分化14例，MK表达的LI中位数为57%（41%，74%）；中分化28例，MK表达的LI为74%（50%，88%）；低分化11例，MK表达的LI中位数为80%（64%，98%），高、中、低分化组两两比较，MK表达差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。
3 讨论
MK最早发现于经视黄酸诱导分化的早期胚胎瘤细胞中，实验发现，MK在妊娠中期的小鼠胚胎中表达广泛，但出生后仅在肾脏中检出，其命名Midkine即来自妊娠中期（mid-gestation）和肾脏（kidney）的缩写[10-11]。已有较多的报道显示，在乳腺癌、肝癌、非小细胞肺癌、Wilm′s瘤、大肠癌等可发现高表达的MK，而在正常组织则未见表达；进一步研究发现，MK具有促进促有丝分裂、细胞分化、肿瘤血管生成、增强纤维蛋白溶解及抗细胞凋亡等作用，并参与肿瘤的发生、演进、生长及转移过程[12-13]。所以
本研究采用免疫组织化学染色方法检测MK在胆囊癌中的表达水平，结果显示，在正常胆囊组织中MK无表达，而在胆囊癌组织中呈高表达。MK在正常胆囊及胆囊良性病变（尤其是胆囊腺瘤）与胆囊癌的标记指数范围没有重叠，正常组织/良性病变组织与癌变组织之间差异有统计学意义（P < 0.05），其染色范围、强度有差异明显，因而根据MK染色能很好的分辨胆囊腺瘤和胆囊癌。这些数据提示MK可作为胆囊癌病理诊断中一个有价值的新的肿瘤标记物。此外，MK在发生淋巴结转移病例中的表达水平显著高于其在无淋巴结转移病例中的表达水平，差异有统计学意义（P < 0.05）；有肝脏浸润的患者MK表达显著高于无肝脏浸润患者的表达，差异有统计学意义（P < 0.05）；有腹腔广泛转移转移的患者MK分子表达显著高于未发生腹腔广泛转移患者的表达，差异有统计学意义（P < 0.05）。临床晚期（S4、S5）患者MK蛋白表达明显高于早中期（S1、S2、S3）患者表达，差异有统计学意义（P < 0.05）。这表明MK蛋白可能与胆囊癌的发生、发展及转移有关，因此，分析MK的表达有助于提示肿瘤预后。胆囊癌治疗时，可以单独依据MK分子表达水平或者再联合其他一些生物指标，将患者分为高危组和低危组，有望提高疗效[14]。
国外研究发现，结肠腺瘤在向结肠癌演变过程中，MK分子由低表达转为大量表达[15-16]。本试验亦发现胆囊腺瘤上皮组织低表达MK，正常胆囊未见表达MK，胆囊癌中高表达MK，差异有统计学意义（P < 0.05），这也许能为胆汁可能刺激胆囊上皮细胞增生、癌变及胆囊腺瘤可在一定条件下癌变提供证据。临床上普遍认为[17]，直径大于9 mm的腺瘤癌变的可能性大，本研究不足之处为腺瘤样本量少，未进行这方面研究。
综上所述，Midkine可作为胆囊癌新的标志物；Midkine表达与胆囊癌发生、发展有关，对胆囊癌的临床分期、浸润转移的估计和患者预后的判断有一定意义。
[参考文献]
Shen W，Park BW，Toms D，et al. Midkine promotes proliferation of primordial germ cells by inhibiting the expression of the deleted in azoospermia-like gene [J]. Endocrinology，2012，153（7）：3482-3492.
Lian T，Meltzer ME，Cannegieter SC，et al. Plaa levels of midkine （neurite growth-promoting factor 2） are not associated withplaa fibrinolytic potential or risk of venous thrombosis [J]. J Thromb Hae most，2012，10（5）：964-966.
[3] Zhao S，Wang H，Nie Y，et al. Midkine upregulates MICA/B expression in human gastric cancer cells and decreases natural killer cell cytotoxicity [J]. Cancer Immunol Immunother，2012，61（10）：1745-1753. [4] 写赛虎，韩小萌，马庆久，等.Midkine、MMP-2在胆囊癌中的表达及其临床意义[J].现代肿瘤医学，2012，20（10）：2130-2132.
[5] 赵秋，马松林，王渝，等.Midkine在胰腺癌组织中的表达及临床意义[J].胰腺病学，2006，6（6）：337-339.
[6] 宝荣，王欣，王佾，等.肝素结合细胞因子Midkine与甲状腺状癌肿瘤生物学特征和BRAF突变的关系[J].中国医科大学学报，2010， 39（7）：518-520.
[7] 张曙光，张林.Midkine基因在肿瘤治疗中的研究进展[J].现代肿瘤医学，2011，19（8）：1681-1684.
[8] Scheper MA，Duarte EC，Intapa C，et al. Expression of midkine in amel oblastomas and its correlation with clinicopathologic parameters [J]. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol，2012，114（4）：497-502.
[9] 吴晓燕，陆晓媛.Midkine、Ki-67和CD34在子宫内膜癌中的表达及其意义[J].徐州医学院学报，2010，30（7）：461-465.
[10] Singh PK，Srivasta V. Recombinant expression and purification of heparin binding proteins： midkine and pleiotrophin from Escherichia coli [J]. Protein Expr Purif，2012，85（2）：181-186.
[11] Erguven M，Bilir A，Yazihan N，et al. Imatinib mesylate decreases the cytotoxic effect of roscovitine on human glioblastoma cells in vitro and the role of midkine [J].Oncol Lett，2012，3（1）：200-208.
[12] 徐军，吴晨光，林江，等.Midkine在胰腺癌诊断中的作用研究[J].中国伤残医学，201
[13] Sakamoto K， Kadomatsu K. Midkine in the pathology of cancer， neural disease， and inflammation [J]. Pathol Int，2012，62（7）：445-455.
[14] Zhao G，Nie Y，Lv M，et al. ERβ-mediated estradiol enhances epithelial mesenchymal transition of lung adenocarcinoma through increasing transcription of midkine [J]. Mol Endocrinol，2012，26（8）：1304-1315.
[15] Gramage E，Martín YB，Herradon G. The heparin binding growth factors midkine and pleiotrophin regulate the antinociceptive effects of morphine through α（2）-adrenergic independent mechanis [J]. Pharmacol Biochem Beh，2012，101（3）：387-393.
[16] Krzystek-Korpacka M，Diakowska D，Grabowski K，et al. Tumor location determines midkine level and its association with the disease progression in colorectal cancer patients： a pilot study [J]. Int J Colorectal Dis，2012，27（10）：1319-1324.
[17] 徐莹莹，刘云鹏.Midkine与恶性肿瘤[J].医学分子生物学杂志，2007， 4（4）：347-349.
（收稿日期：2013-01-10 本文编辑：李继翔）
[关键词] Midkine；表达；胆囊肿瘤；免疫组织化学
[] A [文章编号] 1673-7210（2013）06（a）-0016-03
Midkine（MK）是一种肝素结合性生长分化因子，已有研究表明，MK在多种人类恶性肿瘤组织中可检测到并呈过度表达[1-4]。越来越多的证据表明，MK参与了肿瘤的多种恶性生物学行为，如增殖、迁移、表型转化和血管生成。深入研究MK分子的表达及其与相关临床指标的关系具有重要意义。
原发性胆囊癌发病过程隐匿，且侵袭力强，预后较差，大部分患者在发病后1年内死亡，3年生存率低于11%[5-7]。目前对MK分子在胆囊癌组织中的表达情况及其在胆囊癌发生和演进中所扮演的角色缺乏认识。本研究采用免疫组织化学技术研究胆囊癌、胆囊腺瘤及正常胆囊中MK表达情况，并结合临床病理资料进行统计分析，初步探讨MK分子表达水平与胆囊癌临床病理特征的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集上海长征医院1995年1月～2003年6月外科手术切除的胆囊癌标本53例、胆囊癌转移的淋巴结12例和腹腔转移灶12例。53例胆囊癌患者中男17例，女36例；年龄43～82岁，中位年龄65岁；其中腺癌41例，其他（鳞癌、黏液癌）12例；另收集14例胆囊腺瘤、20例正常胆囊（取自肝移植患者）作对照。14例胆囊腺瘤患者男5例，女9例；年龄42～75岁，中位年龄64岁；20例正常胆囊者男7例，女13例；年龄44～76岁，中位年龄67岁；胆囊癌的一些临床病理资料如组织学分型、分化程度、临床分期、有否局部淋巴结转移、腹腔转移及肝脏浸润等一并记录。其中，淋巴结转移34例，肝脏浸润17例，伴有腹腔广泛转移20例。羊抗Midkine多克隆抗体冻干粉购自美国R&D公司，DO EnVisionTM二步法小鼠试剂盒购自丹麦DO公司。三组年龄、性别等一般资料比较，差异均无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。1.2 研究方法
标本以10%甲醛的液固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片。MK多克隆抗体稀释度1∶100。采用EnVision二步法。所有病理切片均经抗原修复。实验程序按试剂盒说明书进行，磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作阴性对照[8]。1.3 结果判定
MK以细胞胞质内出现清晰棕红色颗粒为阳性判定标准，显微镜下观察在良好的组织结构及清晰的背景上细胞中出现棕红色颗粒为阳性，按以下方法计算MK的标记指数（labelling index，LI）：每一切片在低倍镜下选择组织结构良好、背景清晰的5个阳性细胞最密集的区域，每个区域在高倍镜视野下（200×）计算100个细胞中的阳性细胞数，取5个区域阳性细胞数的平均值作为源于：论文封面www.udooo.com
LI[9]。1.4 统计学方法
采用统计软件SPSS 19.0对数据进行分析，非正态分布的计量资料用中位数（M）及四分位数（P25，P75）表示，采用Wilcoxon秩和检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。2 结果
胆囊癌细胞质及细胞膜呈现棕红色细颗粒状染色，胞核或胞膜单独阳性反应者标记为MK表达阳性（图1）；胆囊腺瘤组织中亦见少量上皮细胞染色，多为胆囊腔的上皮细胞，腺瘤实质内上皮细胞少见染色（图2）。正常胆囊中均未见MK表达。
2.1 MK在胆囊癌、胆囊腺瘤及正常胆囊中的表达
胆囊癌的MK表达LI中位数为72%（41%，98%），胆囊腺瘤MK表达LI中位数为17%（5%，29%），而18例正常胆囊组织均未见染色，其LI为0%，三者LI比较差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表1。2.2 胆囊癌原发灶与转移灶MK表达的关系
胆囊淋巴结转移灶及腹腔转移灶MK表达LI中位数分别为67%（54%，98%）与71%（56%，98%），二者MK表达与原发灶[90%（76%，100%）]比较，差异均有统计学意义（均P < 0.05 ）。见表1。2.3 MK表达与胆囊癌组织学分型及分化程度的关系 53例胆囊癌中腺癌41例，MK表达的LI为70%（41%，86%）；其他（鳞癌、黏液癌）12例，MK表达的LI为75%（50%，98%）。两者比较差异无统计学意义（P > 0.05）。按其分化程度属高分化14例，MK表达的LI中位数为57%（41%，74%）；中分化28例，MK表达的LI为74%（50%，88%）；低分化11例，MK表达的LI中位数为80%（64%，98%），高、中、低分化组两两比较，MK表达差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。
2.4 MK表达与胆囊癌临床分期的关系
按Nevin分期，胆囊癌属S1、S2、S3（早中期）31例，MK表达的LI中位数为64%（41%，85%）；胆囊癌属S4、S5（晚期）22例，MK表达的LI中位数为77%（56%，98%）。前后者比较MK表达差异有统计学意义（P < 0.05）。2.5 MK表达与胆囊癌淋巴结转移、肝脏浸润及腹腔广泛转移的关系
本组胆囊癌淋巴结转移阳性者34例，MK表达的LI中位数为67%（54%，98%）；淋巴结转移阴性性者19例，MK表达的LI为58%（45%，94%）；两者比较MK差异有统计学意义（P < 0.05）。伴有肝脏浸润者17例，MK表达的LI为73%（56%，98%）；无肝脏浸润者36例，MK表达的LI为65%（45%，98%），两者比较差异有统计学意义（P < 0.05）。伴有腹腔广泛转移者20例，MK表达的LI为71%（56%，98%），无腹腔广泛转移者33例，MK表达的LI为63%（45%，98%），两者比较MK差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。3 讨论
MK最早发现于经视黄酸诱导分化的早期胚胎瘤细胞中，实验发现，MK在妊娠中期的小鼠胚胎中表达广泛，但出生后仅在肾脏中检出，其命名Midkine即来自妊娠中期（mid-gestation）和肾脏（kidney）的缩写[10-11]。已有较多的报道显示，在乳腺癌、肝癌、非小细胞肺癌、Wilm′s瘤、大肠癌等可发现高表达的MK，而在正常组织则未见表达；进一步研究发现，MK具有促进促有丝分裂、细胞分化、肿瘤血管生成、增强纤维蛋白溶解及抗细胞凋亡等作用，并参与肿瘤的发生、演进、生长及转移过程[12-13]。所以
源于：查抄袭率本科毕业论文www.udooo.com
，MK水平可以对肿瘤的早期诊断、疗效评价、预测预后及复发提供客观依据。本研究采用免疫组织化学染色方法检测MK在胆囊癌中的表达水平，结果显示，在正常胆囊组织中MK无表达，而在胆囊癌组织中呈高表达。MK在正常胆囊及胆囊良性病变（尤其是胆囊腺瘤）与胆囊癌的标记指数范围没有重叠，正常组织/良性病变组织与癌变组织之间差异有统计学意义（P < 0.05），其染色范围、强度有差异明显，因而根据MK染色能很好的分辨胆囊腺瘤和胆囊癌。这些数据提示MK可作为胆囊癌病理诊断中一个有价值的新的肿瘤标记物。此外，MK在发生淋巴结转移病例中的表达水平显著高于其在无淋巴结转移病例中的表达水平，差异有统计学意义（P < 0.05）；有肝脏浸润的患者MK表达显著高于无肝脏浸润患者的表达，差异有统计学意义（P < 0.05）；有腹腔广泛转移转移的患者MK分子表达显著高于未发生腹腔广泛转移患者的表达，差异有统计学意义（P < 0.05）。临床晚期（S4、S5）患者MK蛋白表达明显高于早中期（S1、S2、S3）患者表达，差异有统计学意义（P < 0.05）。这表明MK蛋白可能与胆囊癌的发生、发展及转移有关，因此，分析MK的表达有助于提示肿瘤预后。胆囊癌治疗时，可以单独依据MK分子表达水平或者再联合其他一些生物指标，将患者分为高危组和低危组，有望提高疗效[14]。
国外研究发现，结肠腺瘤在向结肠癌演变过程中，MK分子由低表达转为大量表达[15-16]。本试验亦发现胆囊腺瘤上皮组织低表达MK，正常胆囊未见表达MK，胆囊癌中高表达MK，差异有统计学意义（P < 0.05），这也许能为胆汁可能刺激胆囊上皮细胞增生、癌变及胆囊腺瘤可在一定条件下癌变提供证据。临床上普遍认为[17]，直径大于9 mm的腺瘤癌变的可能性大，本研究不足之处为腺瘤样本量少，未进行这方面研究。
综上所述，Midkine可作为胆囊癌新的标志物；Midkine表达与胆囊癌发生、发展有关，对胆囊癌的临床分期、浸润转移的估计和患者预后的判断有一定意义。
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Lian T，Meltzer ME，Cannegieter SC，et al. Plaa levels of midkine （neurite growth-promoting factor 2） are not associated withplaa fibrinolytic potential or risk of venous thrombosis [J]. J Thromb Hae most，2012，10（5）：964-966.
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[7] 张曙光，张林.Midkine基因在肿瘤治疗中的研究进展[J].现代肿瘤医学，2011，19（8）：1681-1684.
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[11] Erguven M，Bilir A，Yazihan N，et al. Imatinib mesylate decreases the cytotoxic effect of roscovitine on human glioblastoma cells in vitro and the role of midkine [J].Oncol Lett，2012，3（1）：200-208.
[12] 徐军，吴晨光，林江，等.Midkine在胰腺癌诊断中的作用研究[J].中国伤残医学，201
源于：论文格式字体www.udooo.com
0，18（6）：8-9.[13] Sakamoto K， Kadomatsu K. Midkine in the pathology of cancer， neural disease， and inflammation [J]. Pathol Int，2012，62（7）：445-455.
[14] Zhao G，Nie Y，Lv M，et al. ERβ-mediated estradiol enhances epithelial mesenchymal transition of lung adenocarcinoma through increasing transcription of midkine [J]. Mol Endocrinol，2012，26（8）：1304-1315.
[15] Gramage E，Martín YB，Herradon G. The heparin binding growth factors midkine and pleiotrophin regulate the antinociceptive effects of morphine through α（2）-adrenergic independent mechanis [J]. Pharmacol Biochem Beh，2012，101（3）：387-393.
[16] Krzystek-Korpacka M，Diakowska D，Grabowski K，et al. Tumor location determines midkine level and its association with the disease progression in colorectal cancer patients： a pilot study [J]. Int J Colorectal Dis，2012，27（10）：1319-1324.
[17] 徐莹莹，刘云鹏.Midkine与恶性肿瘤[J].医学分子生物学杂志，2007， 4（4）：347-349.
（收稿日期：2013-01-10 本文编辑：李继翔）