本站原创摘要5-6
ABSTRACT6-10
第1章 前言10-20
1 胰岛素及其类似物10
2 速效胰岛素10-11
3 胰岛素的结构与功能11-15
3.1 胰岛素B22-23转角在胰岛素结构与功能中的作用12-13
3.2 胰岛素B链末端在胰岛素结构与功能中的作用13-15
4 重组胰岛素的蛋白质表达系统15-16
4.1 大肠杆菌表达系统15
4.2 毕赤酵母表达系统15-16
5 糖尿病防治的新方向16-17
5.1 转基因技术16
5.2 中药提取技术16-17
5.3 干细胞技术17
5.4 MicroRNAs与糖尿病17
6 本论文的特点及革新性17-18
6.1 运用IMPACT-TWIN系统表达B22D特点与革新性17
6.2 毕赤酵母表达B27K的特点与革新性17-18
7 实验设计18-20
7.1 内含肽介导的人胰岛素B22D表达流程如下图所示18-19
7.2 人胰岛素B22D的生物制备的设计流程19
7.3 人胰岛素B27K的生物制备实验的设计流程19-20
第2章 胰岛素类似物B22D的生物制备20-39
1 材料和仪器20-21
1.1 菌株和质粒20
1.2 主要生化试剂20
1.3 仪器20-21
2 策略21-27
2.1 感受态制备及质粒转化21
2.2 质粒构建21-24
2.3 诱导表达24
2.4 破菌24-25
2.5 亲和纯化25-26
2.6 胰蛋白酶酶切实验26
2.7 HPLC鉴定与纯化26-27
3. 结果27-37
3.1 质粒pTWINI-B22D的克隆、鉴定27-28
3.2 人胰岛素B22D前体融合蛋白的诱导表达及纯化28-30
3.3 破菌及变复性策略一与策略二的比较30
3.4 剪切条件的优化30-33
3.5 人胰岛素B22D胰蛋白酶酶切33-35
3.6 HPLC-MS鉴定35-36
3.7 B22D产率计算36-37
4. 结论与讨论37-39
4.1 讨论37
4.2 结论37-39
第3章 人胰岛素B27K前体的生物制备39-55
1 材料和仪器39-40
1.1 菌株39
1.2 培养基39
1.3 仪器39
1.4 其它材料39-40
2 策略40-45
2.1质粒DNA大量提取40
2.2 pPIC9K-B27K转化酵母细胞GS11540-41
2.3 基因拷贝数筛选41
2.4 重组质粒pPIC9K-B27K的小量表达41
2.5 重组质粒pPIC9K-B27K的5L发酵41-42
2.6 生长曲线及蛋白浓度测定42
2.7 人胰岛素B27K的纯化42-43
2.8 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳43-44
2.9 Hplc鉴定与纯化44-45
3. 结果45-54
3.1 高拷贝菌株的筛选45-47
3.2 发酵工艺的优化47-50
3.3 人胰岛素B27K前体的制备50-52
3.4 人胰岛素B27K前体的产率计算52
3.5 C8柱HPLC分离纯化52-53
3.6 SRT SEC-150柱HPLC分离纯化53-54
4 结论与讨论54-55
4.1 讨论54
4.2 结论54-55